İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Olgun Bir İmmün Fenotipli Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Benzeri Hücrelere Farklılaşması

Özet

Burada, pluripotent kök hücrelerin beyin mikrovasküler endotel hücresi (BMEC) benzeri hücrelere farklılaşmasını sağlayan genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemi (EECM) olan bir protokolü açıklıyoruz. Bu hücreler endotel hücre adezyon molekülü ekspresyonunu gösterir ve bu nedenle in vitro immün hücre etkileşimlerini incelemek için uygun bir insan kan-beyin bariyer modelidir.

Özet

Kan-beyin bariyeri (BBB) disfonksiyonu, merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen birçok nörodejeneratif ve nöroinflamatuar hastalığın patolojik bir özelliğidir. Hastalıkla ilişkili BBB örneklerine sınırlı erişim nedeniyle, BBB arızasının hastalık gelişimine neden olup olmadığı veya nöroinflamatuar veya nörodejeneratif sürecin bir sonucu olup olmadığı hala iyi anlaşılamamıştır. Bu nedenle, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), sağlıklı donörlerden ve hastalardan in vitro BBB modelleri oluşturmak ve böylece bireysel hastalardan hastalığa özgü BBB özelliklerini incelemek için yeni bir fırsat sunmaktadır. HiPSC'lerden beyin mikrovasküler endotel hücresi (BMEC) benzeri hücrelerin türetilmesi için çeşitli farklılaşma protokolleri oluşturulmuştur. İlgili BMEC-farklılaştırma protokolünün doğru seçimi için spesifik araştırma sorusunun dikkate alınması zorunludur. Burada, hiPSC'leri olgun bir immün fenotipe sahip BMEC benzeri hücrelere ayırmak için optimize edilmiş genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemini (EECM) tarif ediyoruz ve immün hücre-BBB etkileşimlerinin incelenmesine izin veriyoruz. Bu protokolde, hiPSC'ler ilk önce Wnt / β-katenin sinyalini aktive ederek endotelyal progenitör hücrelere (EPC'ler) ayrılır. Düz kas benzeri hücreler (SMLC'ler) içeren elde edilen kültür, daha sonra endotel hücrelerinin (EC'ler) saflığını arttırmak ve BBB'ye özgü özellikleri indüklemek için sırayla geçirilir. EECM-BMEC'lerin bu SMLC'lerle veya SMLC'lerden şartlandırılmış ortamlarla birlikte kültürlenmesi, EC adezyon moleküllerinin tekrarlanabilir, yapısal ve sitokin tarafından düzenlenmiş ekspresyonuna izin verir. Önemli olarak, EECM-BMEC benzeri hücreler, birincil insan BMEC'leri ile karşılaştırılabilir bariyer özellikleri oluşturur ve tüm EC adezyon moleküllerinin ekspresyonu nedeniyle, EECM-BMEC benzeri hücreler diğer hiPSC türevli in vitro BBB modellerinden farklıdır. EECM-BMEC benzeri hücreler, bu nedenle, kişiselleştirilmiş bir şekilde bağışıklık hücresi etkileşimi üzerinde bir etkisi olan BBB düzeyinde hastalık süreçlerinin potansiyel etkisini araştırmak için tercih edilen modeldir.

Giriş

Merkezi sinir sistemindeki (MSS) nörovasküler ünite (NVU), son derece uzmanlaşmış mikrovasküler endotel hücrelerinden (ECs), endotel bazal membranına gömülü perisitlerin yanı sıra parankimal bazal membran ve astrosit uç ayaklarından^{oluşur 1}. NVU içinde, beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC'ler) kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturan temel bileşenlerdir. BMEC'ler karmaşık ve sürekli sıkı kavşaklar oluşturur ve periferik organlardaki mikrovasküler EC'lere kıyasla son derece düşük pinositotik aktiviteye sahiptir, bu da BBB'nin suda çözünür moleküllerin CNS'ye serbest paraselüler difüzyonunu inhibe etmesine izin verir. BMEC'ler tarafından spesifik akış taşıyıcılarının ve efflux pompalarının ekspresyonu, sırasıyla CNS^2'den besin maddelerinin ve zararlı moleküllerin alımını ve ihracatını sağlar. Ek olarak, BBB, CNS^3'e bağışıklık hücresi kaçakçılığı için çok önemli olan düşük seviyelerde endotel adezyon moleküllerini ifade ederek CNS'ye bağışıklık hücresi girişini sıkı bir şekilde kontrol eder. Fizyolojik koşullar altında, hücreler arası adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1) gibi BMEC'lerin yüzeyindeki adezyon moleküllerinin ekspresyon seviyeleri düşüktür, ancak bu seviyeler bazı nörolojik bozukluklarda artmaktadır². BBB'nin morfolojik ve fonksiyonel dağılımı inme⁴, multipl skleroz (MS)⁵ ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ^6,7,8 gibi birçok nörolojik hastalıkta bildirilmiştir. BMEC'lerin hücresel ve moleküler özelliklerinin hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında ayrıntılı olarak araştırılması, BBB'yi hedef alan yeni terapötik stratejilerin belirlenmesinde bir yaklaşımdır.

Yakın zamana kadar, BBB'yi incelemek için birincil veya ölümsüzleştirilmiş insan ve kemirgen BMEC'leri kullanıldı. Bununla birlikte, BBB'nin hayvan modellerine dayanan sonuçların insan BBB'sine kolayca uygulanabilir olup olmadığı belirsizdir, çünkü yapışma molekülleri ve çözünen taşıyıcı proteinler de dahil olmak üzere birkaç önemli molekülün ekspresyonu, insanlar ve kemirgenler arasında farklılık gösterir ^9,10. Her ne kadar hCMEC/D3 gibi insan BMEC çizgileri uygun seviyelerde adezyon molekülleri¹¹ ifade etse de, bu ölümsüzleştirilmiş BMEC'ler genellikle karmaşık sıkı bağlantılara ve sağlam bariyer özelliklerine sahip değildir¹². Birincil insan BMEC'leri bariyer fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır¹³, ancak tüm araştırmacılar için hazır değildir. Ayrıca, hastalardan alınan primer BMEC'lerin elde edilmesi zor olabilir, çünkü sadece belirli klinik koşullar altında gerçekleştirilen bir beyin biyopsisi veya ameliyatı yoluyla toplanmaları gerekir.

Kök hücre teknolojisindeki son gelişmeler, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) gibi kök hücre kaynaklarından kaynaklanan çeşitli insan hücresi tiplerinin farklılaşmasına izin vermiştir. HiPSC türevi modeller, hasta kaynaklı örnekleri kullanarak patofizyolojik modeller oluşturmamızı sağlar. Birkaç hiPSC türevli hücre tipi, fizyolojik koşulları daha iyi taklit eden otolog ko-kültürler veya organoidler oluşturmak için birleştirilebilir. BBB'ye özgü taşıyıcıların ve efflux pompaların ekspresyonu ile sağlam difüzyon bariyeri özelliklerine sahip hiPSC türevli BMEC benzeri hücreleri ayırt etmek için yaygın olarak kullanılan birkaç protokol 14,15,16,17,18,19 kullanılabilir ve küçük moleküllerin paraselüler difüzyonunu, moleküler taşıma mekanizmalarını ve beyne ilaç dağıtımını incelemek için yararlıdır ^20,21. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, yaygın olarak kullanılan hiPSC türevli BMEC benzeri hücrelerin, bağışıklık hücreleri ile BBB²² arasındaki etkileşimlere aracılık etmekten sorumlu olan VCAM-1, selektinler ve ICAM-2 dahil olmak üzere anahtar endotel adezyon moleküllerinin ekspresyonundan yoksun olduğunu göstermiştir. Ayrıca, önceki hiPSC türevli BMEC'lerin transkripsiyonel seviye^23'te karışık endotel ve epitel özellikleri gösterdiği bildirilmiştir. Bu nedenle, hiPSC'lerin morfoloji, bariyer özellikleri ve endotel adezyon molekülü ekspresyonu açısından birincil insan BMEC'lerine benzeyen BMEC benzeri hücrelere farklılaşmasını sağlayan yeni bir protokol olan genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemini (EECM) geliştirdik. Bu protokol, hiPSC'leri olgun bir immün fenotip gösteren BMEC benzeri hücrelere ayırt etmek için ayrıntılı metodolojik prosedürleri açıklamaktadır.

Protokol

Şekil 1: Protokole genel bakış. Makale, hiPSC'leri EECM-BMEC benzeri hücrelere ayırmak için adım adım bir protokol sunmaktadır. Doğru şemalar, her adımda hücre popülasyonlarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

HiPSC hattı HPS1006, RIKEN BRC tarafından MEXT/AMED, Japonya'nın Ulusal Biyo-Kaynak Projesi aracılığıyla sağlandı.

1. Endotelyal progenitör hücrelere (EPC'ler) hiPSC farklılaşmasının indüklenmesi

1. Hücre dışı matris (ECM) kaplı plakalar ve reaktifler
   1. 6 aya kadar -20 °C'de depolamak üzere 50 mL santrifüj tüplerine 2,5 mg matris jeli ayırarak bazal membran matris kaplı 12 delikli plakalar hazırlayın. Buzdolabında (4 °C) saklanan 30 mL soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle'ın orta/besin karışımı F-12'yi (DMEM/F12) tüpe ekleyin. Jel çözülene kadar pipetleyerek hafifçe karıştırın ve ardından 12 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL çözelti ekleyin. Plakayı en az 1 saat boyunca bir inkübatöre (37 ° C,% 5 CO₂) yerleştirin.
      NOT: Bazal membran matris jeli sıcaklığa duyarlıdır ve üreticinin alikotlama ve plaka kaplama talimatlarına göre kullanılmalıdır. Hücre dışı matriks proteinlerinin konsantrasyonu partiler arasında değişebilir. Doğruluğu sağlamak için, kesin konsantrasyon, parti numarası kullanılarak belirli bir parti için kalite sertifikası sayfasında belirtilmelidir. Örneğin, tam konsantrasyon 10.0 mg / mL ise, toplam 2.5 mg için 250 μL jel kullanın.
   2. ROCK inhibitörünü steril suda 10 mM'lik bir konsantrasyona çözerek rho-kinaz (ROCK) inhibitörü stok çözeltisi hazırlayın (Tablo 1). Stok çözeltisini 100-200 μL hacimlerde aliquot edin ve donma-çözülme döngülerini önlemek için -20 ° C'de saklayın.
   3. 5 g L-askorbik asidi 50 mL steril suda çözerek 100 mg/mL'lik bir L-askorbik asit stok çözeltisi yapın ve -20 °C'de saklayın (Tablo 1). Bir LaSR ortamı 24 yapmak için 500 mL gelişmiş DMEM / F12'ye^6.25 mL glutamin ve 305 μL L-askorbik asit stok çözeltisi ekleyin (Tablo 1). 2-8 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
   4. CHIR99021'i seyreltilmemiş dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM'lik bir nihai konsantrasyona çözerek CHIR99021 çözeltisini hazırlayın (Tablo 1). Donma-çözülme döngülerini önlemek için çözeltiyi 100-200 μL hacimlere ayırın ve -20 ° C'de 1 yıla kadar saklayın. Stok çözeltisinin çalışma alikotlarını 4 ° C'de 1 aya kadar saklayın.
   5. 450 mL DMEM/F12'ye 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ekleyerek DMEM/F12-10 ortamını hazırlayın. Ortamı 2-8 ° C'de 1 aya kadar saklayın (Tablo 1).
   6. 467 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (PBS) 33,3 mL% 7,5 sığır serum albümini (BSA) ekleyerek akış tamponu-1'i hazırlayın (Tablo 1). 2-8 °C'de 6 aya kadar saklayın.
2. Tekilleştirilmiş hiPSC'lerin tohumlanması ve EPC farklılaşması için genişleme (Gün -3 - Gün -1)
   1. 6 delikli bir plakadaki hiPSC kolonileri kendiliğinden farklılaşma göstermediğinde ve tipik olarak yaklaşık% 80 akıcılık (2.5-3.5 x 10⁶ hücre) olan geçiş için uygun yoğunluğa sahip olduğunda farklılaşmaya başlayın. Farklılaşmamış hücreleri ortadan kaldırmak için çoklu pasajların gerekli olup olmadığından emin olmak için mikroskop altında kendiliğinden farklılaşmış hücreleri dikkatlice izleyin. Hücre kültürü, ortam ve hücre dışı matris hakkında bilgi için adım 1.4.15'in altında verilen nota bakın.
   2. Ortamı aspire edin ve kuyucuklara 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin. Ayrışma reaktifi çözeltisini kuyucukların yüzeyleri üzerinde nazikçe iki veya üç kez pipetleyerek hücreleri ayrıştırın ve tekilleştirin.
   3. Ayrılan hücreleri 4 mL hiPSC bakım ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri iyice askıya alın. Hücre sayımı için 10 μL'lik bir aliquot ayırın.
   4. 20-25 °C'de 200 x g'de 5 dakika santrifüj yaparak hücreleri peletleyin. Hücreleri sayın ve bazal membran matris kaplı 12 delikli plakada uygun bir hiPSC yoğunluğu (kuyu başına 75-400 x 10³ ) elde etmek için gerekli hacmi hesaplayın (adım 1.1.1).
   5. Kaplama çözeltisini kuyucuklardan aspire edin ve her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL hiPSC ortamı ekleyin (1:1.000 seyreltme). Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve peleti 1 mL hiPSC ortamında ayırın.
   6. Adım 1.2.4'te belirlenen gerekli hiPSC hacmini 12 delikli plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Bir hiPSC klonunu ayırt etmek için iki ila dört adet 12 delikli plaka yeterli olabilir. Hücrelerin tohumlanması için gereken plaka sayısını belirlemek için adım 1.2.4'e bakın.
   7. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin (37 ° C,% 5 CO₂). Plakayı yavaşça ileri geri kaydırarak ve ardından inkübatörde yan yana kaydırarak hücreleri eşit olarak dağıtın.
   8. Ertesi gün (yani, Gün -2), ortamı ROCK inhibitörü olmayan 2 mL hiPSC bakım ortamı ile değiştirin. Ertesi gün (Gün -1), ortamı 2 mL taze hiPSC bakım ortamı ile değiştirin.
3. EPC'lerin glikojen sentaz kinaz 3 (GSK-3) inhibitörü CHIR99021 ile indüksiyonu (Gün 0 ila Gün 5)
   1. 0. Günde, her bir kuyucuktaki hiPSC bakım ortamını, 8 μM CHIR99021 içeren 2 mL LaSR ortamıyla değiştirin.
   2. 1. Günde, ortamı aspire edin ve 8 μM CHIR99021 içeren 2 mL taze LaSR ortamı ekleyin.
   3. 2, 3 ve 4. Günlerde, ortamı CHIR99021'den yoksun 2 mL taze LaSR ortamı ile değiştirin.
4. CD31'i saflaştırmak için manyetik aktif hücre sıralama (MACS)⁺ EPC'ler (5. Gün)
   1. 5. Günde, ortamı aspire edin ve daha sonra 37 ° C'de 6-8 dakika inkübe etmeden önce her bir oyuğa 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin.
   2. Hücreleri bir mikropipetle ayrıştırın ve tekilleştirin ve süspansiyonu 10 mL DMEM / F12-10 ortamı içeren 50 mL'lik bir tüpe filtrelemek için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. İkiden fazla 12 delikli plakadan toplanan hücre süspansiyonunu en az iki 50 mL tüpe filtreleyin.
   3. DMEM/F12-10 ortamı (50 mL'ye kadar) ekleyerek sindirim reaksiyonunu durdurun. Pipeti iyice toplayın ve hücreleri saymak için 10 μL ayırın. 20-25 °C'de 200 x g'de 5 dakika santrifüj yaparak hücreleri peletleyin.
   4. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu taze 15 mL tüplere aktarın. 20-25 °C'de 200 x g'de 5 dakika santrifüj yaparak hücreleri peletleyin.
   5. Süpernatantı aspire edin ve 100 μL tampon başına 1.0 x 10⁷ hücre yoğunluğunda akış tamponu-1'e yeniden askıya alın.
   6. 1:100 oranında FcR bloke edici reaktif ekleyin ve 1:200 oranında seyreltilmiş floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli CD31 antikoru eklemeden önce 5 dakika inkübe edin. Süspansiyonu karanlıkta 20-25 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   7. CD31⁺ hücrelerinin fraksiyonunu belirlemek için akış sitometri analizi için süspansiyonun 10 μL'sini ayırarak 10 mL akış tamponu-1 ekleyin (Şekil 2).
   8. 20-25 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yaparak hücreleri peletleyin. Ardından, süpernatantı çıkarın ve 100 μL akış tamponu-1 çözeltisi başına 1.0 x 10⁷ hücrelik bir yoğunluğa yeniden askıya alın. FITC seçim kokteylini ekleyin (100 μL hücre süspansiyonu başına 5 μL). Pipetleme ile iyice karıştırın ve karanlıkta 20-25 °C'de 15 dakika inkübe edin.
   9. 100 μL hücre süspansiyonu başına 5 μL manyetik nanopartikül ekleyin, iyice pipet yapın ve karanlıkta 20-25 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
   10. Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir akış sitometri tüpüne aktarın ve toplam 2,5 mL'lik bir hacim elde etmek için akış tamponu-1 ekleyin. Akış sitometri tüpünü mıknatısın içine 5 dakika boyunca yerleştirin.
   11. Sürekli bir hareketle, mıknatısı ters çevirin ve FITC-CD31 antikoru ile etiketlenmemiş hücreleri içeren hücre süspansiyonunu boşaltın. Mıknatısı ve tüpü 2-3 s boyunca ters konumda tutun ve ardından kalan sıvıyı çıkarın. Tüpü dik konuma getirmeden önce tüp kenarındaki damlacıkları aspire edin.
   12. Akış sitometri tüpünü mıknatıstan alın ve kalan CD31⁺ hücrelerini yıkamak için 2,5 mL akış tamponu-1 ekleyin. Hücreleri iki veya üç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek hücreleri yeniden askıya alın. Akış tüpünü mıknatısın içine 5 dakika boyunca yerleştirin.
   13. Toplam dört yıkama için 1.4.11-1.4.12 adımlarını üç kez ve ardından 1.4.11 adımını bir kez daha tekrarlayın.
   14. Akış tüpünü mıknatıstan çıkarın ve saflaştırılmış CD31 ⁺ hücrelerini yeniden askıya almak için tüpe belirtilen miktarda uygun bir ortam (örneğin, genişletilmiş EC kültürü için insan endotelyal serumsuz ortam [hECSR] veya dondurma için dondurma ortamı) ekleyin. Biri hücre sayımı için, ikincisi ise MACS sonrası örneklerde CD31⁺ hücrelerinin saflığını değerlendirmek için akış sitometri analizi yapmak üzere süspansiyonun iki adet 10 μL alikotunu ayırın (Şekil 2). Bir akış sitometresi hemen mevcut değilse, alikotu analize kadar 4 ° C'de saklayın.
   15. Sonraki adımlar (2. adıma kadar) hemen gerçekleştirilemezse, CD31⁺ EPC'leri bu noktada dondurun. EPC'lerin genişletilmesi ve seçici geçişi için adım 2'ye geçin.
       NOT: Vitronectin²⁵ kaplamalı 12 delikli plakalar ve daha kararlı hiPSC bakım ortamı (mTeSR plus), bazal membran matris kaplı plakalar ve hiPSC bakım ortamı (mTeSR1) yerine kullanılabilir. Vitronektin kaplı 12 delikli plakalar hazırlamak için, vitronektini seyreltme tamponu ile 10 μg / mL'lik nihai bir konsantrasyona seyreltin ve daha sonra seyreltilmiş çözeltinin 500 μL'sini 12 delikli plakaların her bir kuyucuğuna aktarın. Plakaları en az 1 saat boyunca 20-25 ° C'de bırakın. Tekilleştirilmiş hiPSC'lerin tohumlama yoğunluğu, bazal membran matris kaplı plakalar için kullanılanla karşılaştırılabilir. Kültür ortamının veya matris kompozisyonunun değiştirilmesi, yeni kültür koşullarına uyum sağlamak için tipik olarak 1-2 hafta gerektiren hiPSC'lerin çoğalmasını ve kendiliğinden farklılaşmasını etkileyebilir. HiPSC bakımı için daha kararlı hiPSC bakım ortamı kullanılıyorsa, bu ortam hiPSC bakım ortamı yerine EPC ayrımı için kullanılabilir. Bu durumda, ROCK inhibitörünü çıkarmak için daha kararlı hiPSC bakım ortamı Gün -2'de değiştirilmelidir ve Gün -1'deki değişim atlanabilir.

2. Beyin mikrovasküler endotel hücre benzeri hücreleri (BMEC benzeri hücreler) ve düz kas benzeri hücreleri (SMLC'ler) ayırt etmek için genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemi (EECM)

1. Kollajen kaplı plakaların ve reaktiflerin hazırlanması
   1. 5 mg kristalize kollajen tip IV'ü 5 mL steril suda çözerek kollajen kaplı 6 delikli plakalar hazırlayın. -20 °C'de alikotasyon yapmadan ve depolamadan önce gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 10 μg/mL çözeltiler üretmek için kollajen IV aliquots 1:100'ü steril suda seyreltin ve 6 delikli plakaların her bir kuyucuğuna 1 mL 10 μg/mL kollajen IV çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 ° C'de en az 30 dakika inkübe edin. Plakalar 37 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
   2. 500 μg FGF'yi 5 mL Dulbecco'nun PBS'sinde çözerek insan fibroblast büyüme faktörü 2'nin (FGF2) stok çözeltisini hazırlayın, % 0.1'lik nihai konsantrasyona% 7.5 BSA ekleyin ve stok çözeltisini 20-200 μL hacimlere ayırın. Bunlar -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir (Tablo 1). Stok çözeltileri 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir; Donma-çözülme döngülerinden kaçının. 98 mL hECSR ortamına 2 mL B-27 takviyesi ve 20 μL FGF2 ekleyerek hECSR ortamını hazırlayın (Tablo 1). hECSR ortamı 2-8 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
   3. 30 mL hECSR ortamına 15 mL fetal sığır serumu, 5 mL DMSO ve 25 μL ROCK inhibitörü çözeltisi ekleyerek EPC'ler, EECM-BMEC benzeri hücreler ve SMLC'ler için dondurma ortamı hazırlayın (Tablo 1). Donma ortamı 2-8 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
2. Genişletilmiş endotel hücre kültürü için EPC'lerin tohumlanması
   1. Kollajen çözeltisini 6 delikli plakalardan çıkarın. Daha sonra, 1.0-2.0 x 10 5 saflaştırılmış CD31⁺ EPC'leri,⁵ μM ROCK inhibitörü (1:2.000 seyreltme) içeren 2 mL hECSR ortamında aktarın. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin (37 ° C,% 5 CO₂). Plakaları yavaşça ileri geri, sonra yan yana kaydırarak hücreleri eşit şekilde dağıtın.
   2. Ertesi gün, ROCK inhibitörü içeren hECSR ortamını çıkarın ve ROCK inhibitörü olmadan 2 mL taze hECSR ortamı ekleyin. %100 birleşme noktasına ulaşana kadar hECSR ortamını her gün değiştirin.
      NOT: Bir hafta sonu boyunca düzenli bir beslenme programı sürdürülemezse, ortam haftanın son iş gününün akşamında ve hafta sonundan sonraki sabahın erken saatlerinde tekrar değiştirilebilir.
3. EECM-BMEC benzeri hücreleri ve SMLC'leri saflaştırmak için seçici geçiş
   1. hECSR ortamını, ECs ve EC olmayan popülasyonların bir karışımını içeren 6 delikli plakalardan çıkarın. Her bir kuyucuğa 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin.
   2. Hücre morfolojisini mikroskop altında dikkatlice izleyin. EC'ler (ancak EC olmayanlar değil) parlak ve yuvarlak göründüğünde (tipik olarak 2-5 dakika içinde), plakanın kenarına dokunarak bunları ayırın. EC olmayanların çoğu plakaya bağlı kalır.
   3. Ayrılmış EC'leri bir mikropipet kullanarak toplayın ve EC olmayanların yeniden askıya alınmasını önlemeye özen gösterin. ECs'yi 1 mL ayrışma reaktifi başına 4 mL DMEM/F12-10 içeren 15 mL veya 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
   4. SMLC'leri oluşturmak için kalan ekli EC olmayanları içeren kuyucuklara 2 mL hECSR ortamı ekleyin.
   5. İyice karıştırmak için santrifüj tüpündeki EC süspansiyonunu pipetleyin ve hücre sayımı için süspansiyonun 10 μL'sini ayırın. Kalan hücreleri 20-25 °C'de 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı peletten çıkarın ve 1.0-2.0 x 10⁵ ECs başına 2 mL hECSR ortamı ekleyin.
   6. Kollajen IV çözeltisinin yeni bir 6 delikli plakadan çıkarılması üzerine, her bir kuyucuğa 2 mL EC süspansiyonu ekleyin, ardından %5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübasyon yapın. Hücreleri plakaya eşit olarak dağıtmak için, inkübatör rafında ileri geri ve yan yana hareket halinde yavaşça hareket ettirin.
   7. ECs %100 akıcılığa ulaşana kadar hECSR ortamını her gün değiştirin.
   8. Saf bir EC tek katmanı elde edilene kadar 2.3.1-2.3.7 arasındaki adımları tekrarlayın. Aşağıdaki adımlar gerçekleştirilemezse, CD31⁺ EC'leri dondurun (bkz. adım 2.4.2). EC fonksiyonlarını analiz etmek için adım 3'e geçin.
      NOT: Genel olarak, fonksiyonel analizler için uygun olan neredeyse saf ECs kültürlerini elde etmek için iki veya üç seçici pasaj gereklidir ve bu hücreleri EECM-BMEC benzeri hücreler olarak kabul ederiz. Beş veya altıdan fazla pasajdan sonra, hücre proliferasyonu tipik olarak yavaşlar, ancak bu değişken hiPSC hattına bağlıdır.
   9. SMLC'leri kültüre almak için, hECSR ortamını her gün değiştirin. SMLC koşullandırılmış ortamı (CM) toplamak için, toplanan ortamı her ortam değişiminde 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin. CM, EECM-BMEC benzeri hücrelerin VCAM-1 ekspresyonunu yukarı regüle etmek için kullanılabilir. SMLC'ler% 100 akıcılığa ulaşana kadar SMLC-CM'yi havuzlayın.
4. EPC, EECM-BMEC benzeri hücre ve SMLC kriyoprezervasyon ve çözme
   1. EPC'leri dondurmak için, son MACS yıkamasını (adım 1.4.13) takiben, EPC'leri 1.0-2.0 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta hECSR ortamı yerine dondurucu ortamda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini kriyotüplere dağıtın. Kriyotüpleri kontrollü bir hızlı dondurma cihazına yerleştirin ve hızlı bir şekilde -80 ° C'ye aktarın. Uzun süreli depolama için, tüpleri dondurulduktan 24 ila 48 saat sonra sıvı azot tankına taşıyın.
   2. EECM-BMEC benzeri hücreleri ve SMLC'leri dondurmak için, ortamı kuyucuklardan çıkardıktan sonra, ayrışma reaktifi (1 mL / kuyu) ekleyin ve plakayı, hücreler ayrılana kadar% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin (EECM-BMEC benzeri hücreler ve SMLC'ler için sırasıyla 5-7 dakika ve 20-30 dakika). Hücreleri, 1 mL ayrışma reaktifi başına 4 mL DMEM / F12-10 içeren 15 mL veya 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
   3. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini iyice karıştırmak ve ayırmak için pipet. 20-25 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yaparak hücreleri peletleyin. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri donma ortamında 1.0-2.0 x 10⁶ hücre / mL yoğunluğa kadar iyice askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini taze kriyotüplere dağıtın.
   4. Kriyotüpleri kontrollü bir dondurma cihazına yerleştirin ve hemen -80 ° C'ye aktarın. Uzun süreli depolama için, tüpler dondurulduktan 24 ila 48 saat sonra bir sıvı azot tankına aktarılabilir.
   5. EPC'leri, EECM-BMEC benzeri hücreleri ve SMLC'leri çözmek için, kriyotüp şişelerini eller arasında yuvarlayın veya hücreler neredeyse tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin. 500 μL DMEM/F12-10 ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça 4 mL DMEM/F12-10 ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Kriyotüpü 1 mL DMEM / F12-10 ekleyerek bir kez yıkayın ve ardından hücreleri 20-25 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin.
   6. Süpernatantı aspire edin ve peleti 5 μM ROCK inhibitörü (1:2.000 seyreltme) içeren 2 mL hECSR ortamında, EPC'ler için 2 mL başına 1.0-2.0 x 10 5 hücre yoğunluğuna ve EECM-BMEC benzeri hücreler ve SMLC'ler için 2 mL başına 2.0-3.0 x 10⁵ hücre yoğunluğuna yeniden askıya alın. Kollajen çözeltisini aspire ettikten sonra hücre süspansiyonunu kollajen kaplı 6 delikli plakaların kuyucukları arasında dağıtın.
   7. Hücreleri kuyucuklara eşit olarak dağıtmak için plakaları yavaşça ileri geri, sonra yan yana, bir inkübatörün rafında 37 ° C, % 5 CO_2'de hareket ettirin.
   8. Ertesi gün, ortamı ROCK inhibitörü olmayan taze hECSR ortamı ile değiştirin. %100 akıcılık elde edilene kadar hECSR ortamını her gün değiştirin. Ardından, EPC'ler için seçici geçişe (bkz. adım 2.3) ve EECM-BMEC benzeri hücreler için fonksiyonel analizlere (bkz. adım 3) geçin. Moleküler karakterizasyon ve fonksiyonel tahliller yapılmadan önce, EECM-BMEC benzeri hücreler, tipik olarak çözülmeden 2-3 gün sonra elde edilen% 100 birleşici olmalıdır.

3. EECM-BMEC benzeri hücrelerin ve SMLC'lerin doğrulanması

1. Küçük molekül izleyicileri için geçirgenlik testi
   1. EECM-BMEC benzeri hücre bariyer bütünlüğünü, Nishihara ve ^ark.26 tarafından tanımlandığı gibi sodyum floresein geçirgenliğini ölçerek değerlendirin. Tam tek katmanlı geliştirmek ve sodyum floreseinin geçirgenliğini ölçmek için EECM-BMEC benzeri hücreleri filtre ekleri üzerine tohumlayın.
2. Anahtar molekülleri değerlendirmek için immünofloresan boyama.
   1. Tek katmanlı EECM-BMEC benzeri hücrelerin veya SMLC'lerin bileşke moleküllerinin, adezyon moleküllerinin veya sitoiskelet proteinlerinin ekspresyonunu izlemek üzere immünofloresan boyama için, oda slaytları, 96 delikli plakalar veya kesici uç filtreli membranlar kullanın. Nishihara ve ^ark.26 tarafından tanımlandığı gibi, enflamatuar sitokin stimülasyonu olan veya olmayan hücre yüzey adezyon moleküllerinin EECM-BMEC benzeri hücre ekspresyonunu değerlendirin.
3. EECM-BMEC benzeri hücreler üzerindeki hücre yüzey adezyon moleküllerinin ekspresyonunu analiz etmek için akış sitometrisi
   1. Nishihara ve ^ark.26 tarafından tanımlandığı gibi, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selektin, E-selektin, CD99 ve trombosit endotelyal hücre adezyon molekülü-1 (PECAM-1) dahil olmak üzere CNS'ye immün hücre göçünde rol oynayan hücre yüzey adezyon moleküllerinin yarı kantitatif ekspresyonunu değerlendirmek için akış sitometrisini kullanın. Kültür: SMLC şartlandırılmış ortama sahip EECM-BMEC benzeri hücreler, 16-18 saat boyunca enflamatuar sitokinlerin varlığında ve yokluğunda.
4. Fonksiyonel adezyon moleküllerinin ekspresyonunu değerlendirmek için statik koşullar altında immün hücre adezyon testi
   1. EECM-BMEC benzeri hücrelerin hücre yüzeyi yapışma moleküllerinin işlevsel olup olmadığını belirlemek için Nishihara ve ^ark.26 tarafından açıklanan yöntemi kullanın.
   2. Kısaca, EECM-BMEC benzeri hücreleri 5.5 x 10⁴ /^cm2'de bir oda slaydına tohumlayın ve birleşerek büyütün. Yaklaşık 24 saat sonra, pro-inflamatuar sitokinlerin varlığında veya yokluğunda kültür ortamını SMLC şartlandırılmış ortama değiştirin ve EECM-BMEC benzeri hücreleri 16 saat daha inkübe edin.
   3. Deney gününde, kriyokorunmuş bağışıklık hücrelerini (örneğin, T hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreleri [PBMC'ler]) T hücresi yıkama tamponu (Tablo 1) ile çözün ve T hücresi ortamında floresan boyalarla (örneğin, hücre izleyici boyaları) etiketleyin (Tablo 1). Bağışıklık hücreleri için kültür ortamının optimizasyonu, çalışılan spesifik bağışıklık hücresi tipine göre uyarlanmalıdır.
   4. 16 delikli bir oda slaytında, EECM-BMEC benzeri hücrelere 2 x 10⁴ Th1 hücreleri ekleyin. Spesifik olarak, Th1 hücreleri gibi efektör T hücreleri ile çalışırken, PBMC'lere kıyasla EECM-BMEC benzeri hücrelere daha fazla bağlanma sergiledikleri gözlenmiştir (Nishihara. et al. [2022]). Sonuç olarak, EECM-BMEC benzeri hücrelere eklenecek PBMC sayısının saf efektör T hücrelerine kıyasla daha yüksek olması gerekir.
   5. Bağışıklık hücrelerini, göç tahlil ortamında 30 dakika boyunca EECM-BMEC benzeri hücrelerin tek katmanı ile inkübe edin (Tablo 1). 30 dakika sonra, Dulbecco'nun PBS'sini içeren bir kavanoza daldırarak slaydı nazikçe iki kez yıkayın ve daha sonra 2 saat boyunca 4 ° C'de% 2.5 glutaraldehit çözeltisi ile sabitleyin.
   6. Sabitlemeden sonra, Dulbecco'nun PBS'sini içeren bir kavanoza daldırarak slaydı iki kez yıkayın ve bir kapak kayması ile monte edin. Daha sonra, EECM-BMEC benzeri hücre tek katmanlarına bağlı bağışıklık hücrelerini saymak için slaytlardaki tek katmanın merkezinin floresan mikroskobu görüntülerini elde edin.

Sonuçlar

Geçirgenlik testi
Sodyum floreseinin geçirgenliği, alt odadan toplanan ortamın floresan yoğunluğunun 15, 30, 45 ve 60 dakikada ölçülmesiyle hesaplanmıştır. Her zaman noktasında toplam 150 μL ortam örneklenir ve eksik hacim olan 150 μL, hECSR ortamı ile değiştirilir. floresan yoğunluğu bir floresan plaka okuyucu (485 nm uyarma/530 nm emisyon) kullanılarak okunur ve doğru sinyaller, boşluk hacimleri ve geçirgenlikler daha önce açıklanan bir formül¹⁸ kullanılarak hesaplanır (Tablo 2). Sodyum floreseinin floresan yoğunluğunun zamanla artıp artmadığını doğrulamanız önerilir. Tekrarlanabilirliği sağlamak için bir test için birden fazla filtre - en azından üçlü - kullanılmalıdır. Sağlıklı kontrol kaynaklı EECM-BMEC benzeri hücreler için, sodyum floresein (376 Da) geçirgenliği 0.3 x ^10-3 cm / dak'nın altında olmalıdır. Akıcı bir EECM-BMEC benzeri hücre tek katmanının oluşumunu doğrulamak için, geçirgenlik testlerinde kullanılan her filtrenin EECM-BMEC benzeri hücrelerinin bileşke proteinleri için immünofloresan boyama bu tahlili takiben yapılmalıdır.

İmmünofloresan boyama
Claudin-5, oklüdin ve VE-kadherin¹ dahil olmak üzere EECM-BMEC benzeri hücre bileşke moleküllerinin immünofloresan boyaması, hücre morfolojisini ve sürekli ve olgun kavşakların varlığını değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 4). Filtre uçlarının membranları üzerindeki EECM-BMEC benzeri hücrelerin tek katmanları, 20 s boyunca soğuk metanol (-20 ° C) ile sabitlendi, bloke edici tamponla bloke edildi (Tablo 1) ve daha sonra birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edildi. EECM-BMEC benzeri hücreler, her ikisi de BMEC'lerin karakteristik morfolojik özellikleri olan iğ benzeri şekiller ve zikzak şeklinde kavşaklar sergiledi²⁷. SMLC türevli şartlandırılmış ortamda seyreltilmiş tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve interferon-γ (INF-γ) (0.1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ) gibi pro-inflamatuar sitokinlerle odacık slaytlara tohumlanan EECM-BMEC benzeri hücrelerin uyarılması, ICAM-1 ve VCAM-1²⁸ gibi yapışma moleküllerinin ekspresyonunu yukarı regüle etmiştir (Şekil 5). α-düz kas aktini (SMA), kalponin ve düz kas proteini 22-Alpha (SM22a)²⁹ dahil olmak üzere düz kas hücresi belirteçlerinin temsili görüntüleri Şekil 6'da gösterilmiştir. Oda slaydına tohumlanan SMLC'ler 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitlendi, bloke edici tamponla bloke edildi ve daha sonra birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edildi.

EECM-BMEC benzeri hücreler tarafından hücre yüzey adezyon molekülü ekspresyonunun akış sitometrisi analizi
EECM-BMEC benzeri hücreler üzerindeki endotel adezyon moleküllerinin hücre yüzeyi ekspresyonu için temsili sonuçlar Şekil 7'de gösterilmiştir. TNF-α ve INF-γ gibi pro-inflamatuar sitokinlerle stimülasyon, ICAM-1, VCAM-1 ve P-selektin dahil olmak üzere çeşitli adezyon moleküllerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu yukarı regüle eder. EECM-BMEC benzeri hücrelerin SMLC şartlandırılmış orta gelişmiş endotelyal VCAM-1 hücre yüzey ekspresyonu ile yetiştirilmesi. VCAM-1 hücre yüzeyi ekspresyonunun indüksiyonunun etkisi, SMLC şartlandırılmış ortamın partileri arasında değişebilir. Hangi partinin VCAM-1'in uygun ifadesini indüklediğini doğrulamak için, SMLC'leri ayırt ederken, aynı hiPSC kaynağından türetilen SMLC'lerden toplanan birkaç partili şartlandırılmış ortamın depolanması önerilir.

Statik koşullar altında immün hücre adezyon testi
Bağlı bağışıklık hücrelerinin sayısı, EECM-BMEC benzeri hücrelerin yüzeyindeki fonksiyonel adezyon moleküllerinin ekspresyon seviyesi ile korelasyon gösterdi. İnflamatuar sitokinlerle stimülasyon, endotel adezyon moleküllerinin ekspresyonunu yukarı regüle etti ve EECM-BMEC benzeri hücre monokatmanlarına yapışan artan bağışıklık hücrelerinin sayısını arttırdı (Şekil 8). Mevcut deney, EECM-BMEC benzeri hücreler üzerindeki adezyon moleküllerinin işlevselliğini gösterdi ve bu modeli bağışıklık hücresi-EC etkileşimlerini incelemek için uygun hale getirdi.

Şekil 2: CD31⁺ EC'lerin saflaştırılması. MACS'den önce (adım 1.4.7) ve sonra (adım 1.4.14) hücre popülasyonlarının EC'lerin saçılma kapısından ve FITC etiketli CD31 boyamasından elde edilen temsili akış sitometri verilerinin nokta grafikleri. MACS, popülasyondaki CD31⁺ EPC'lerin saflığını artırır. Kısaltmalar: SSC = yan saçılma; FSC = ileri saçılma; FITC = floresein izotiyosiyanat; MACS = manyetik aktif hücre sıralama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: EECM-BMEC-monolayer geçirgenliği (^10-3 cm/dak), sodyum floreseinin ham floresan yoğunluğundan hesaplanmıştır. Boşluk hacminin doğrusal eğimi, her filtre için doğrusal regresyon kullanılarak hesaplanır (Şekil 3A). Sodyum floreseinin geçirgenliği iki formül kullanılarak hesaplanır (Şekil 3B). (A) Boşluk hacminin zamana karşı doğrusal eğimi, filtre 1 (m_c1) ve boş filtre (m_f) için doğrusal regresyon kullanılarak hesaplanmıştır. m c1 ve m f, sırasıyla X_c1 ve X_f katsayılarıdır. (B) m_c ve m_f (Formül 1) kullanarak floresein geçirgenliğini (Pe) hesaplamak için formül. Pe birimleri, bir filtrenin yüzey alanı kullanılarak dönüştürüldü (Formül 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: EECM-BMEC benzeri hücreler olgun hücresel kavşaklar gösterir. Kesici uç filtrelerin membranlarında yetiştirilen EECM-BMEC benzeri hücrelerde claudin-5, oklüdin veya VE-kadherin (kırmızı) için immünofloresan boyama. Çekirdekler 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) kullanılarak boyandı. Boyama, geçirgenlik testleri için kullanılan filtre uçlarının aynısı üzerinde gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Endotel adezyon moleküllerinin EECM-BMEC benzeri hücreler tarafından ekspresyonu. SMLC türevli CM varlığında filtre uçlarının zarları üzerinde yetiştirilen EECM-BMEC benzeri hücreler üzerinde immünofloresan boyama yapıldı. uyarılmamış ve 1 ng / mL TNF-α + 20 IU / mL IFN- γ uyarılmış EECM-BMEC benzeri hücreler için ICAM-1 veya VCAM-1 (kırmızı) için immün boyama gösterilmiştir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: SMLC'lerin karakterizasyonu. Oda slaytlarında yetiştirilen SMLC'ler için α-düz kas aktini (SMA), kalponin veya düz kas proteini 22-Alpha (SM22a) (kırmızı) immünositokimyası gösterilmiştir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: EECM-BMEC benzeri hücreler üzerindeki adezyon moleküllerinin endotel hücre yüzeyi ekspresyonu. EECM-BMEC benzeri hücreler üzerindeki EC yüzey adezyon molekülü ekspresyonunun akış sitometri analizinin sonuçları gösterilmiştir. EECM-BMEC benzeri hücreler, SMLC kaynaklı şartlandırılmış ortam kullanılarak kültürlendi. Histogram kaplamalarının mavi, kırmızı ve gri çizgileri sırasıyla uyarılmamış (NS) durumu, 1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN-γ uyarılmış durumu ve izotip kontrolünü gösterir. Hücreler arası adezyon molekülü 1 (ICAM-1), ICAM-2, vasküler hücre adezyon molekülü 1 (VCAM-1), P-selektin, E-selektin, CD99 ve trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM-1) dahil olmak üzere endotel adezyon moleküllerinin hücre yüzey ekspresyonu değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Bağışıklık hücrelerinin EECM-BMEC benzeri hücreler üzerine yapışması. (A) Uyarılmamış (NS) ve 0.1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ ile uyarılmış (TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC benzeri hücre tek katmanları üzerinde floresan olarak etiketlenmiş yapışkan bağışıklık hücrelerinin görüntüleri. Görüntüler kuyuların merkezlerine karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) NS ve TNF-α + IFN-γ ile uyarılmış EECM-BMEC benzeri hücrelerin tek katmanları üzerinde floresan olarak etiketlenmiş bağışıklık hücrelerinin sayısı. Yapışkan bağışıklık hücreleri / görüş alanları (FOV'lar) FIJI yazılımı kullanılarak otomatik olarak sayıldı. Noktalar, ekli T hücrelerinin sayısını temsil eder. Çubuklar ortalama değeri, hata çubukları ise sekiz denemenin standart sapmasını (SD) gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tahliller için spesifik reaktiflerin detayları. Her bir spesifik reaktif için bileşenlerin adı ve tam miktarı açıklanmaktadır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Pe hesaplaması için floresan plaka okuyucunun ham veri örneği. Kalın yazı tipindeki sayılar, bir plaka okuyucu tarafından ölçülen sodyum floreseinin ham floresan yoğunluğudur. Verileri doğru bir şekilde analiz etmek için, arka plan sinyalini ham değerlerden çıkarmak ve alt odanın örneklenmesinden kaynaklanan herhangi bir sinyal kaybını hesaba katmak ve ardından sinyali düzeltmek gerekir. Örneğin, arka planı çıkardıktan sonra, 15 dakikalık örnek 100 göreceli floresan birimi (RFU) sinyali sergiler ve 30 dakikalık örnek 150 RFU'luk bir sinyal sergiler. 30 dakikada düzeltilen sinyal (150 RFU + 15 dakikada eksik değerler [100 RFU x 150 μL/1.500 μL]), yani 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU'dur. Boşluk hacmi = (1.500 x [S B,t])/(S T,60 dk), burada 1.500 alt haznenin hacmidir (1.500 μL), S B,t t zamanında düzeltilmiş sinyaldir ve S _{T,60 dk}, üst haznenin₆₀ dakikadaki sinyalidir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Kritik noktalar ve sorun giderme
EPC farklılaşmasına başlamadan önce, araştırmacılar hiPSC kültürlerinde spontan hücre farklılaşma olaylarının meydana gelmediğinden emin olmalıdır. Spontan olarak farklılaşmış hücrelerin yokluğu ve saf hiPSC kolonilerinin kullanımı, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. -3. Gündeki hiPSC tohumlama yoğunluğu, MACS'den sonra yüksek saflıkta CD31⁺ EPC elde etmek için önemlidir. Her hiPSC hattı ve her geçiş için tohumlama yoğunluğu optimizasyon gerektirebilir. HiPSC hattına ve geçiş numarasına bağlı olarak, tohumlama yoğunluğu 12 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 75 x 10 3 ila 400 x 10 3 hiPSC arasında değişebilir (20-100 x 10³ /^cm2). HiPSC'lerin minimum yoğunluk kontrol noktası, 2. Gündeki hücre yoğunluğudur. HiPSC'ler en geç 2. güne kadar %100 akıcılığa ulaşmalıdır. HiPSC'ler 2. Güne kadar birleşmezse, MACS'den sonra CD31 ⁺ EPC'lerin saflığı genellikle oldukça düşük olacaktır. Bu durumda, hiPSC tohumlama yoğunluğu arttırılabilir. Çok sayıda farklılaştırıcı hücre 3. Günden 5. Güne kadar plakadan ayrılırsa, başlangıçtaki hiPSC tohumlama yoğunluğu azaltılabilir. Deneyimlerimize göre 7-8 μM CHIR99021, burada kullanılan hiPSC hatları için en uygun konsantrasyondur, ancak konsantrasyonun, inhibitör tedavisine farklı yanıt verebilecek diğer hiPSC hatları için optimize edilmesi gerekebilir. CD31⁺ EPC'lerin saflığı MACS'den önce ve sonra onaylanmalıdır. MACS'e devam etmeden önce, önceden sıralanmış hücre karışımı% >10 CD31 ⁺ hücreleri olmalıdır. CD31 ⁺ hücre yüzdeleri% <6 tipik olarak MACS'den sonra% <80 EPC ile sonuçlanır. Bu durumda ilk tohumlama yoğunluğunun ve / veya CHIR99021 konsantrasyonunun optimizasyonu gereklidir.

Başarılı seçici geçiş ve saf EC tek katmanlarının oluşturulması için CD31⁺ EPC'lerin MACS sonrası saflığı kritik öneme sahiptir. MACS'den sonraki saflık% <90 ise, bir veya iki ek yıkama önerilir (adım 1.4.11-1.4.12). İdeal olarak, MACS sonrası saflık% >95 olmalıdır. Kollajen kaplı plakalardaki EPC tohumlama yoğunluğu, 3-7 gün içinde %100 akıcılık elde etmek için hiPSC hattına göre optimize edilmelidir. EC'ler% 100 akıcı olana kadar beklemek genellikle başarılı seçici geçişe yol açacaktır. Bununla birlikte, %100 akışkan EC'ler için bile, bazı hiPSC hatlarının SMLC'leri de erken ayrılır. Bu durumda, daha düşük akıcılıkta seçici geçiş (örneğin, %≤80) etkili olabilir. Bazı SMLC'ler EC'lerden daha erken ayrılırsa, EC'ler genellikle karışık EC-SMLC popülasyonundan kurtarılamaz. Bu durumda, geçen EC'lerde ayrışma reaktifi için aktivasyon süresinin kısaltılması ve tekrarlayan seçici geçişler yararlı olabilir. Bir ayrışma reaktifi olarak tripsin yerine ticari bir ayrışma reaktifinin kullanılması, seçici geçiş için faydalıdır, çünkü tripsin EC'lerin ve SMLC'lerin ayrı ayrılmasına izin vermez. Küçük molekül izleyicileri kullanan geçirgenlik testlerimiz ve sıkı bağlantı ve adezyon molekülü ekspresyon seviyelerinin test edilmesi, EPC'lerin, EECM-BMEC benzeri hücrelerin ve SMLC'lerin sıvı azotta en az 2 yıl saklanabileceğini göstermektedir.

Yöntemin önemi ve sınırlamaları
Yöntem, Wnt / β-katenin sinyalini aktive etmek için kimyasal GSK-3 inhibitörleri kullanarak CD31 ⁺ EPC'leri hiPSC'lerden ayırır. CD31 ⁺ EPC'lerin MACS tarafından pozitif seçiminden sonra, EPC'ler karışık endotel ve SMLC popülasyonlarına farklılaşmayı teşvik eden tanımlanmış bir endotel ortamında kültürlenir. Farklı yapışkan özelliklere sahip bu karışık popülasyonların seçici geçişi, EC'lerin SMLC'lerden ayrılmasını sağlar. Bir veya iki geçişten sonra, EECM-BMEC benzeri hücreler bariyer özellikleri ve birincil insan BMEC'lerininkini özetleyen endotel adezyon moleküllerinin ekspresyonunu sergiler. SMLC'ler veya süpernatantları ile ko-kültür, VCAM-1'in sitokin kaynaklı ekspresyonunu indükler.

In vivo, BBB, moleküllerin düşük parasellüler ve transsellüler geçirgenliğini sağlayarak, besinlerin spesifik taşıyıcılar yoluyla taşınması ve CNS'ye bağışıklık hücresi kaçakçılığının kontrolü yoluyla CNS homeostazını korur. BBB çalışmaları için, ilgili molekülleri ve ilgilenilen fonksiyonları gösteren uygun bir model gereklidir. EECM-BMEC benzeri hücrelerin tanımlanmış reaktifler ve hastalardan veya sağlıklı deneklerden alınan örnekler kullanılarak üretilmesi, ölçeklenebilir bir insan BBB modeli sağlar. EECM-BMEC benzeri hücreleri kullanan bir modelin diğer BBB modellerine göre avantajları şunlardır: 1) birincil insan BMEC'lerininkine benzeyen bir morfoloji ve endotel transkriptom profili³⁰; 2) olgun sıkı bağlantıların varlığı; 3) arzu edilen bariyer özellikleri; ve 4) ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- ve P-selektin, CD99, melanom hücre adezyon molekülü (MCAM) ve aktive lökosit hücre adezyon molekülü (ALCAM^{) dahil} olmak üzere endotel adezyon moleküllerinin sağlam ekspresyonu22. Bu nedenle, bu model bağışıklık hücreleri ve BMEC'ler arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle yararlıdır. Küçük molekül izleyicilerinin geçirgenliği, EECM-BMEC benzeri hücreler için, iPSC türevi BMEC^{benzeri hücreler için} daha önce bildirilenden daha yüksek olmasına rağmen, bariyer ^{özellikleri, birincil} insan BMEC'leri için tarif edilenlerle oldukça iyi karşılaştırılmaktadır. Bu benzerlik, EECM-BMEC benzeri hücrelerin BBB'nin iyi bir in vitro modeli olabileceğini göstermektedir. Fizyolojik koşullar altında EECM-BMEC benzeri hücreler üzerindeki E-selektin ekspresyonu, in vivo^31'de kurucu E-selektin ekspresyonundan yoksun iltihapsız BBB'leri incelemek için bu modeli kullanırken dikkate alınmalıdır. Önceki çalışmamızda, EECM-BMEC benzeri hücrelerin, MS hastalarının beyinlerinde bozulmuş sıkı kavşaklara göre gözlemlendiği gibi, BBB'yi fenoskopi yapabileceğini gösterdik. Bu, küçük moleküllerin daha yüksek geçirgenliği ve fonksiyonel adezyon molekülünün ekspresyonunun artmasıyla sonuçlanır, bu da bağışıklık hücrelerinin BMEC benzeri hücreler boyunca artan yapışmasına ve transmigrasyonuna aracılık eder³². Ayrıca, Wnt / β-katenin sinyallemesinin aktivasyonunun, MS kaynaklı EECM-BMEC benzeri hücrelerde sıkı kavşakların bozulmasını ve VCAM-1 ekspresyonunu artırabileceğini gösterdik³². Bu sonuçlar, modelin BBB'nin MS gibi nöroimmünolojik hastalıklardaki rolünü incelemek için gerçekten yararlı olduğunu göstermektedir.

Birlikte ele alındığında, EECM-BMEC benzeri hücreler, BBB düzeyinde patofizyolojik mekanizmaların derinlemesine anlaşılması için umut verici bir araçtır ve BBB stabilizasyonu için yeni terapötik hedefler geliştirmek için bir araçtır. Gelecekte, model BBB disfonksiyonunu daha geniş bir hastalık spektrumunda incelemek için uygulanabilir ve yeni terapötik yaklaşımlar için yollar açabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm Syringe filter	TPP	99722
15 mL Centrifuge tube	Falcon	352196
40 μm Falcon cell strainer	Falcon	352340
5 mL Round-bottom tube	SPL	40005
50 mL Centrifuge tube	Falcon	352070
96-Well plate, round bottom	SPL	34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X810
B-27 Supplement (503), serum free	Thermo Fischer Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS	Sigma-Aldrich	A8412
CellAdhere Dilution Buffer	STEMCELL Technologies	ST-07183
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Chamber slides	Thermo Fischer Scientific	178599
CHIR99021	Selleck Chemicals	S1263
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Corning tissue culture plates (12-well)	Corning	3512
Corning tissue culture plates (6-well)	Corning	3506
Cryo tube innercap 2.0 mL	Watson	1396-201S
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate	Thermo Fischer Scientific	31053-028
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium)	Thermo Fisher	14190250
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC Positive Selection Kit II	STEMCELL Technologies	18558
EasySepMagnet	Stemcell Technologies	18000
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS	Sigma	E8008-100ML
Fetal Bovine Serum, qualified	Thermo Fischer Scientific	10270106
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Ficoll-Paque PLUS	Sigma-Aldrich	GE17144002
FIJI software (Version 2.0.0)	Image J, USA
FlowJo version10	BD
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G6257
HCL	Sigma-Aldrich	H1758
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	11111-044
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2)	Tocris	233-FB-500
iPS human induced pluripotent stem cells	Riken RBC	HPS1006
Kanamycin Sulfate (100x)	Thermo Fischer Scientific	15160-047
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamine 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	11140-035
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381
mTeSR Plus-cGMP	STEMCELL Technologies	ST-100-0276
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement)	STEMCELL Technologies	85850
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Paraformaldehyde	Millipore	104005
Pen Strep	Thermo Fischer Scientific	15140-122
Recombinant Human IFN-gamma Protein	R&D Systems	285-IF-100
Recombinant Human IL-2	BD Biosciences	554603
Recombinant Human TNF-alpha Protein	R&D Systems	210-TA-020
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254
RPMI medium 1640	Thermo Fischer Scientific	21875-034
Scalpel	FEATHER	2975-11
Skim milk	BD Biosciences	232100
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	71290
Sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	11360-039
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated	Corning	3401
Tris base	Sigma-Aldrich	93362
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vitronectin XF	STEMCELL Technologies	078180
Water, sterile, cell culture	Sigma-Aldrich	W3500