الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي

Summary

يوفر التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية للرئيسيات نهجا دقيقا وفعالا لإدخال تعديل (تعديلات) وراثية عابرة في أنواع مختلفة من السلف والخلايا العصبية في نظام نموذجي قريب من تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (المرضية). هذا يسمح بدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية ويمكن أيضا تطبيقه على نمذجة المرض.

Abstract

القشرة الدماغية هي بنية الدماغ الخارجية وهي مسؤولة عن معالجة المدخلات الحسية والمخرجات الحركية. ينظر إليه على أنه مقر القدرات المعرفية العليا في الثدييات ، على وجه الخصوص ، الرئيسيات. تعد دراسة وظائف الجينات في أدمغة الرئيسيات أمرا صعبا لأسباب تقنية وأخلاقية ، لكن إنشاء تقنية العضو العضوي في الدماغ مكن من دراسة نمو الدماغ في نماذج الرئيسيات التقليدية (على سبيل المثال ، المكاك الريسوس والمارموسيت الشائع) ، وكذلك في أنواع الرئيسيات التي كان يتعذر الوصول إليها تجريبيا (على سبيل المثال ، القردة العليا) ، في نظام مبرر أخلاقيا وأقل تطلبا من الناحية الفنية. علاوة على ذلك ، تسمح عضويات الدماغ البشري بالتحقيق المتقدم في الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية.

نظرا لأن عضويات الدماغ تلخص العديد من عمليات نمو الدماغ ، فإنها تمثل أيضا أداة قوية لتحديد الاختلافات في المحددات الجينية الكامنة وراء نمو الدماغ لمختلف الأنواع في سياق تطوري ومقارنتها وظيفيا. ميزة كبيرة لاستخدام المواد العضوية هي إمكانية إدخال تعديلات وراثية ، مما يسمح باختبار وظائف الجينات. ومع ذلك ، فإن إدخال مثل هذه التعديلات أمر شاق ومكلف. تصف هذه الورقة نهجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة لتعديل مجموعات الخلايا وراثيا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات الدماغية الرئيسية ، وهي نوع فرعي من عضويات الدماغ. تجمع هذه الطريقة بين بروتوكول معدل للتوليد الموثوق به من العضويات الدماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس والخلايا الجذعية المستحثة المشتقة من المارموسيت (iPSCs) مع نهج الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي. يوفر هذا أداة فعالة لدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية التي يمكن تطبيقها أيضا لنمذجة المرض.

Introduction

يعد التحقيق في التطور الفسيولوجي (المرضي) وتطور القشرة الدماغية مهمة هائلة يعوقها عدم وجود أنظمة نموذجية مناسبة. في السابق ، كانت هذه الدراسات تقتصر على نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (مثل السلف العصبي الأولي أو مزارع الخلايا العصبية) والنماذج الحيوانية البعيدة تطوريا (مثل القوارض)^1,2. في حين أن هذه النماذج مفيدة لمعالجة بعض الأسئلة ، إلا أنها محدودة في نمذجة التعقيد ، وتكوين نوع الخلية ، والبنية الخلوية ، وأنماط التعبير الجيني للقشرة المخية البشرية النامية في الحالات الصحية والمريضة. وتؤدي هذه القيود، على سبيل المثال، إلى ضعف قابلية ترجمة نماذج الفئران للأمراض البشرية إلى الحالة البشرية، كما هو موصوف بالن....

Protocol

1. ثقافة iPSCs الرئيسيات

ملاحظة: نظرا لقوتها ، يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا على أي خط iPSC الرئيسيات. في هذه المقالة ، نصف إنتاج الأعضاء الدماغية من الإنسان (iLonza2.2) 29 ، والشمبانزي (Sandra A) ³⁰ ، المكاك الريسوس (iRh33.1) ²⁹ ، وخطوط marmoset الشائعة (cj_160419_5) ³¹ iPSC. يتم تلخيص ظروف الاستزراع في الجدول 1. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. لزراعة iPSCs المعنية ، اتبع ظروف الاستزراع الموصوفة في الأصل. بشكل ....

النتائج

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بالتوليد الفعال للعضويات الدماغية من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس وخطوط iPSC الشائعة مع الحد الأدنى من تغييرات التوقيت المطلوبة بين الأنواع (الشكل 1 أ). يمكن تزويد هذه الكائنات العضوية بالكهرباء في حدود 20 dps إلى 50 dps ، اعتمادا على إمكانية الو?.......

Discussion

تمثل الإجراءات الموصوفة هنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من أنواع رئيسية مختلفة مع نهج التثقيب الكهربائي المستهدف. وهذا يسمح بالتعبير خارج الرحم لحكومة إسرائيل في نظام نموذجي يحاكي تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (بما في ذلك الإنسان) (المرضي). يستخدم هذا البروتو.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305