الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي

Summary

يوفر التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية للرئيسيات نهجا دقيقا وفعالا لإدخال تعديل (تعديلات) وراثية عابرة في أنواع مختلفة من السلف والخلايا العصبية في نظام نموذجي قريب من تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (المرضية). هذا يسمح بدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية ويمكن أيضا تطبيقه على نمذجة المرض.

Abstract

القشرة الدماغية هي بنية الدماغ الخارجية وهي مسؤولة عن معالجة المدخلات الحسية والمخرجات الحركية. ينظر إليه على أنه مقر القدرات المعرفية العليا في الثدييات ، على وجه الخصوص ، الرئيسيات. تعد دراسة وظائف الجينات في أدمغة الرئيسيات أمرا صعبا لأسباب تقنية وأخلاقية ، لكن إنشاء تقنية العضو العضوي في الدماغ مكن من دراسة نمو الدماغ في نماذج الرئيسيات التقليدية (على سبيل المثال ، المكاك الريسوس والمارموسيت الشائع) ، وكذلك في أنواع الرئيسيات التي كان يتعذر الوصول إليها تجريبيا (على سبيل المثال ، القردة العليا) ، في نظام مبرر أخلاقيا وأقل تطلبا من الناحية الفنية. علاوة على ذلك ، تسمح عضويات الدماغ البشري بالتحقيق المتقدم في الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية.

نظرا لأن عضويات الدماغ تلخص العديد من عمليات نمو الدماغ ، فإنها تمثل أيضا أداة قوية لتحديد الاختلافات في المحددات الجينية الكامنة وراء نمو الدماغ لمختلف الأنواع في سياق تطوري ومقارنتها وظيفيا. ميزة كبيرة لاستخدام المواد العضوية هي إمكانية إدخال تعديلات وراثية ، مما يسمح باختبار وظائف الجينات. ومع ذلك ، فإن إدخال مثل هذه التعديلات أمر شاق ومكلف. تصف هذه الورقة نهجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة لتعديل مجموعات الخلايا وراثيا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات الدماغية الرئيسية ، وهي نوع فرعي من عضويات الدماغ. تجمع هذه الطريقة بين بروتوكول معدل للتوليد الموثوق به من العضويات الدماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس والخلايا الجذعية المستحثة المشتقة من المارموسيت (iPSCs) مع نهج الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي. يوفر هذا أداة فعالة لدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية التي يمكن تطبيقها أيضا لنمذجة المرض.

Introduction

يعد التحقيق في التطور الفسيولوجي (المرضي) وتطور القشرة الدماغية مهمة هائلة يعوقها عدم وجود أنظمة نموذجية مناسبة. في السابق ، كانت هذه الدراسات تقتصر على نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (مثل السلف العصبي الأولي أو مزارع الخلايا العصبية) والنماذج الحيوانية البعيدة تطوريا (مثل القوارض)^1,2. في حين أن هذه النماذج مفيدة لمعالجة بعض الأسئلة ، إلا أنها محدودة في نمذجة التعقيد ، وتكوين نوع الخلية ، والبنية الخلوية ، وأنماط التعبير الجيني للقشرة المخية البشرية النامية في الحالات الصحية والمريضة. وتؤدي هذه القيود، على سبيل المثال، إلى ضعف قابلية ترجمة نماذج الفئران للأمراض البشرية إلى الحالة البشرية، كما هو موصوف بالنسبة لحالات معينة من صغر الرأس (على سبيل المثال، Zhang et ^al.3). في الآونة الأخيرة ، أصبحت الرئيسيات غير البشرية المعدلة وراثيا ، والتي تعد نموذجا أقرب تطوريا ووظيفيا ومورفولوجيا لتطور القشرة المخية الحديثة البشرية ، موضع تركيز⁴،^5،6،^7،8 لأنها تتغلب على العديد من قيود زراعة الخلايا والنماذج القائمة على القوارض. ومع ذلك ، فإن استخدام الرئيسيات غير البشرية في البحث ليس مكلفا للغاية ويستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل يثير أيضا مخاوف أخلاقية. في الآونة الأخيرة ، ظهر تطوير تقنية الدماغ العضوية ^9,10 كبديل واعد يحل العديد من قيود النماذج السابقة 11،¹²،^13،14،^15،16.

عضويات الدماغ هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) ، متعددة الخلايا تحاكي السمات الرئيسية للهندسة الخلوية وتكوين نوع الخلية لمنطقة واحدة أو عدة مناطق دماغية لنافذة زمنية تنموية محددة¹¹،12،¹³،^14،17. يتم إنشاء هذه الهياكل 3D إما من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) أو ، إذا كانت متاحة للأنواع ذات الاهتمام ، من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs). بشكل عام ، يمكن التمييز بين نوعين من عضويات الدماغ بناء على المنهجية المستخدمة: عضويات الدماغ غير الموجهة والإقليمية (الموجهة)¹⁸. عند توليد النوع الأخير من الكائنات العضوية ، يتم توفير جزيئات أو عوامل صغيرة توجه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى عضويات في منطقة معينة من الدماغ (على سبيل المثال ، عضويات الدماغ الأمامي)¹⁸. على النقيض من ذلك ، في الكائنات العضوية غير الموجهة ، لا يسترشد التمايز بإضافة جزيئات صغيرة ولكنه يعتمد حصريا على التمايز التلقائي ل iPSCs / ESCs. تتكون عضويات الدماغ الناتجة من أنواع الخلايا التي تمثل مناطق مختلفة من الدماغ (على سبيل المثال ، عضويات دماغية)¹⁸. تجمع عضويات الدماغ بين العديد من السمات الرئيسية لنمو الدماغ مع توليد فعال نسبيا من حيث التكلفة والوقت من أي نوع من أنواع الاهتمام التي تتوفر لها iPSCs أو ESCs¹¹،¹²،^13،14. هذا يجعل عضويات الدماغ نموذجا ممتازا للعديد من أنواع الدراسات البيولوجية العصبية ، بدءا من الأسئلة التطورية والتنموية إلى نمذجة الأمراض واختبار الأدوية^15,16. ومع ذلك ، فإن معالجة مثل هذه الأسئلة باستخدام عضويات الدماغ تعتمد بشدة على توافر طرق مختلفة للتعديل الوراثي.

أحد الجوانب الرئيسية لدراسة التطور الفسيولوجي للقشرة المخية الحديثة (المرضية) وتطورها هو التحليل الوظيفي للجينات ومتغيرات الجينات. يتم تحقيق ذلك عادة عن طريق التعبير (خارج الرحم) و / أو عن طريق الضربة القاضية (KD) أو الضربة القاضية (KO) لتلك الجينات. ويمكن تصنيف هذه التعديلات الجينية إلى تعديل وراثي مستقر وعابر، وكذلك إلى تعديلات مقيدة زمانيا ومكانيا أو غير مقيدة. يتم تعريف التعديل الوراثي المستقر من خلال إدخال تغيير جيني في جينوم المضيف ينتقل إلى جميع أجيال الخلايا اللاحقة. اعتمادا على النقطة الزمنية للتعديل الوراثي ، يمكن أن يؤثر على جميع خلايا العضو أو يمكن أن يقتصر على مجموعات خلايا معينة. في أغلب الأحيان ، يتم تحقيق تعديل وراثي مستقر في عضويات الدماغ على مستوى iPSC / ESC من خلال تطبيق الفيروسات العدسية ، والأنظمة الشبيهة بالترانسبوزون ، وتقنية CRISPR / Cas9 (تمت مراجعتها من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et ^al.19 و Teriyapirom et ^al.20). هذا له ميزة أن جميع خلايا الدماغ العضو تحمل التعديل الجيني وأنه غير مقيد زمانيا أو مكانيا. ومع ذلك ، فإن توليد وتوصيف خطوط iPSC / ESC المستقرة هذه يستغرق وقتا طويلا للغاية ، وغالبا ما يستغرق عدة أشهر حتى يمكن تحليل أول عضويات دماغية معدلة (تمت مراجعته بواسطة Fischer et al.17 أو Kyrousi et ^al.19 أو Teriyapirom et ^al.20).

في المقابل ، يتم تعريف التعديل الجيني العابر من خلال توصيل البضائع الجينية (على سبيل المثال ، بلازميد التعبير الجيني) الذي لا يندمج في جينوم المضيف. في حين أن هذا التعديل يمكن ، من حيث المبدأ ، أن ينتقل إلى أجيال الخلايا اللاحقة ، فإن الشحنة الجينية المسلمة سيتم تخفيفها تدريجيا مع كل انقسام خلوي. لذلك ، عادة ما يكون هذا النوع من التعديل الوراثي مقيدا زمانيا ومكانيا. يمكن إجراء التعديل الوراثي العابر في عضويات الدماغ عن طريق الفيروسات المرتبطة بالغدي أو عن طريق التثقيب الكهربائي (تمت مراجعته من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et ^al.19 و Teriyapirom et ^al.20) ، مع وصف الأخير بالتفصيل في هذه المقالة. على عكس التعديل الوراثي المستقر ، فإن هذا النهج سريع للغاية وفعال من حيث التكلفة. في الواقع ، يمكن إجراء التثقيب الكهربائي في غضون دقائق ، واعتمادا على مجموعة (مجموعات) الخلايا المستهدفة ، تكون الكائنات العضوية الكهربائية جاهزة للتحليل في غضون أيام (تمت مراجعتها من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et ^al.19). ومع ذلك ، لا يمكن اكتشاف التغيرات المورفولوجية الإجمالية للعضو في الدماغ ، مثل الاختلافات في الحجم ، باستخدام هذه الطريقة ، لأن هذا النوع من التعديل الوراثي مقيد زمانيا ومكانيا. يمكن أن يكون هذا التقييد أيضا ميزة ، على سبيل المثال ، في حالة دراسة مجموعات الخلايا الفردية داخل العضو العضوي أو التأثيرات على عضويات الدماغ في نقاط زمنية محددة للنمو (تمت مراجعته من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et ^al.19).

النهج الكلاسيكي لدراسة وظيفة الجينات أثناء نمو الدماغ وتطوره هو في التثقيب الكهربائي للرحم. في الرحم التثقيب الكهربائي هو تقنية معروفة ومفيدة لتوصيل تركيبات التعبير الجيني إلى القوارض 21،²²،23 والنمس^24،25 أدمغة. أولا ، يتم حقن محلول يحتوي على بنية (تصانيب) التعبير ذات الأهمية من خلال جدار الرحم في بطين معين من الدماغ الجنيني ، اعتمادا على المنطقة المراد استهدافها. في الخطوة الثانية ، يتم تطبيق نبضات كهربائية لنقل الخلايا المبطنة مباشرة للبطين المستهدف. لا يقتصر هذا النهج فقط على التعبير خارج الرحم أو الإفراط في التعبير عن الجينات ، حيث يمكن تطبيقه أيضا في دراسات KD أو KO عن طريق الحقن الدقيق لدبوس الشعر القصير (shRNA) أو CRISPR / Cas9 (في شكل بلازميدات التعبير أو البروتينات النووية الريبية [RNPs]) ، على التوالي^26,27. ومع ذلك ، فإن التثقيب الكهربائي في الرحم لأجنة الفئران والجرذان والنمس له نفس القيود الموضحة أعلاه لهذه النماذج الحيوانية.

من الناحية المثالية ، يود المرء أن يؤدي في التثقيب الكهربائي للرحم مباشرة في الرئيسيات. في حين أن هذا ، من حيث المبدأ ، ممكن تقنيا ، إلا أن التثقيب الكهربائي في الرحم لا يتم في الرئيسيات بسبب المخاوف الأخلاقية ، وارتفاع تكاليف صيانة الحيوانات ، وأحجام القمامة الصغيرة. بالنسبة لبعض الرئيسيات ، مثل القردة العليا (بما في ذلك البشر) ، هذا غير ممكن على الإطلاق. ومع ذلك ، فإن هذه الرئيسيات لديها أكبر إمكانات لدراسة تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية البشرية (المرضية) وتطورها. أحد الحلول لهذه المعضلة هو تطبيق تقنية التثقيب الكهربائي على عضويات الدماغ^{الرئيسية 28}.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتثقيب الكهربائي لنوع فرعي من عضويات دماغ الرئيسيات ، وهي عضويات دماغية الرئيسيات. يسمح هذا النهج بالتعديل الوراثي السريع والفعال من حيث التكلفة لمجموعات الخلايا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات. على وجه التحديد ، وصفنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من الإنسان (الإنسان العاقل) ، والشمبانزي (Pan troglodytes) ، المكاك الريسوس (Macaca mulatta) ، والمارموسيت الشائع (Callithrix jacchus) iPSCs. علاوة على ذلك ، نصف تقنية الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي بالتفصيل ونقدم معايير "go" و "no-go" لأداء التثقيب الكهربائي العضوي الدماغي الرئيسي. هذا النهج هو أداة فعالة لدراسة (المرض) تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية وتطورها في نموذج قريب بشكل خاص من الوضع البشري.

Protocol

1. ثقافة iPSCs الرئيسيات

ملاحظة: نظرا لقوتها ، يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا على أي خط iPSC الرئيسيات. في هذه المقالة ، نصف إنتاج الأعضاء الدماغية من الإنسان (iLonza2.2) 29 ، والشمبانزي (Sandra A) ³⁰ ، المكاك الريسوس (iRh33.1) ²⁹ ، وخطوط marmoset الشائعة (cj_160419_5) ³¹ iPSC. يتم تلخيص ظروف الاستزراع في الجدول 1. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. لزراعة iPSCs المعنية ، اتبع ظروف الاستزراع الموصوفة في الأصل. بشكل عام ، من أجل التوليد الناجح والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية ، استخدم خطوط iPSC التي لم يتم استزراعها لأكثر من 90 مقطعا. بالإضافة إلى ذلك ، في بداية توليد الأعضاء الدماغية ، تأكد من أن iPSCs تظهر ميزات تعدد القدرات مع عدم وجود علامات على التمايز.

2. توليد العضويات الدماغية من الرئيسيات iPSCs

ملاحظة: يعتمد بروتوكول توليد الأعضاء التناسلية الدماغية على نسخة معدلة²⁸،30،32،³³ من بروتوكول العضو العضوي الدماغي الأصلي^10،34 مع بعض التعديلات الخاصة بالأنواع (مفصلة أدناه).

1. بذر iPSCs لتوليد أجسام جنينية (EBs)
   1. بمجرد أن تصل iPSCs إلى التقاء 80٪ -90٪ ، اغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، وأضف 500 ميكرولتر من بديل التربسين المؤتلف أو 1 مل من خليط تحلل البروتين والكولاجين.
      ملاحظة: عادة ، يتم استزراع iPSCs في طبق زراعة خلية 60 مم للحصول على ما يقرب من 900000 خلية ، وهو ما يكفي لتوليد 96 عضويا دماغيا. يمكن تعديل أرقام الخلايا اعتمادا على عدد المواد العضوية المطلوبة. كن على علم بأنه ليس كل الكائنات العضوية الدماغية المتولدة قد تكون مناسبة للتثقيب الكهربائي.
   2. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لفصل الخلايا.
      ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 2 دقيقة إضافية من الحضانة عند 37 درجة مئوية اعتمادا على خط iPSC أو الإنزيم المستخدم. ينصح بفحص الطبق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد بدأت في الانفصال.
   3. أضف 1.5 مل من وسط زراعة iPSC المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) لإيقاف التفاعل ، والماصة لأعلى ولأسفل 7x-10x (لا تزيد عن 10x) لفصل الخلايا عن طبق زراعة الخلية والحصول على تعليق أحادي الخلية.
   4. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل ، وطرد مركزي الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من وسط زراعة iPSC المكمل إما بمركب 50 ميكرومتر Y27632 أو 50 ميكرومتر مؤيد للبقاء على قيد الحياة.
   6. استخدم 10 ميكرولتر من معلق الخلية لحساب الخلايا باستخدام غرفة نيوباور.
   7. اضبط معلق الخلية إلى تركيز 9000 خلية لكل 150 ميكرولتر (60000 خلية / مل) باستخدام وسط ثقافة iPSC المكمل بمركب 50 ميكرومتر Y27632 أو 50 ميكرومتر مؤيد للبقاء على قيد الحياة.
   8. لتوليد أجسام جنينية (EBs) ، قم بزرع 150 ميكرولتر من معلق الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئر منخفضة للغاية. أثناء السحب ، هز الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية برفق لمنع الخلايا من الترسيب.
   9. استزرع EBs في جو رطب من 5٪ CO₂ و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية (0 يوم بعد البذر [dps]). لا تزعج EBs خلال أول 24 ساعة بعد البذر.
      ملاحظة: يجب استزراع EBs المتولدة من iPSCs marmoset في جو رطب تحت ظروف نقص الأكسجين (5٪ CO 2 و 5٪ O 2 و 90٪ N ₂) عند 37 درجة مئوية.
   10. بعد ~ 48 ساعة (2 dps) ، قم بتغيير الوسيط إلى وسيط ثقافة iPSC بدون مركب Y27632 / pro-survival . قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ، وأضف 150 ميكرولتر من الوسط الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بدون Y27632. اذهب صفا تلو الآخر.
   11. إجراء المزيد من التغييرات المتوسطة كل يوم ؛ قم بإزالة 150 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ، وأضف 150 ميكرولتر من الوسط الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بدون Y27632 / مركب مؤيد للبقاء لكل بئر.
       ملاحظة: بعد 4-5 dps ، يجب أن يصبح محيط EBs شفافا.
2. تحريض الأديم الظاهر العصبي
   ملاحظة: بشكل عام، يجب أن يكون للبرامج البيئية عالية الجودة ملامح سلسة وحدود شفافة في هذه المرحلة. تختلف النقاط الزمنية للحث العصبي اختلافا طفيفا بين أنواع الرئيسيات وخطوط iPSC. في حالة خطوط الخلايا المستخدمة هنا (انظر القسم 1 وجدول المواد) ، عادة ما يحتاج الحث العصبي ل marmoset EBs إلى البدء عند 4 dps ، لقرود المكاك الريسوس عند 5 dps ، و EBs البشرية والشمبانزي عند 4-5 dps (الشكل 1A) ، اعتمادا على حالة EBs (انظر أعلاه).
   1. قم بإزالة 150 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من الصف الأول من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، وأضف 150 ميكرولتر من وسط الحث العصبي المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (انظر الجدول 2) لكل بئر في نفس الصف.
   2. استمر في تغيير الوسيط كما هو موضح أعلاه صفا تلو الآخر للوحة 96 بئرا بأكملها. قم بإجراء المزيد من التغييرات في وسط الحث العصبي (NIM) كل يوم عن طريق إزالة 150 ميكرولتر من NIM من كل بئر وإضافة 150 ميكرولتر من NIM الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، يجب استزراع EBs marmoset في نفس الظروف مثل EBs الرئيسيات الأخرى (جو رطب من 5٪ CO₂ و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية).
3. التضمين في مصفوفة الغشاء القاعدي
   ملاحظة: بمجرد أن تطور EBs ظهارة عصبية واضحة وشفافة ومنظمة شعاعيا على السطح ، يجب توفير الدعم الهيكلي لتطوير هياكل تشبه البطين. يتم تحقيق ذلك من خلال تضمين EBs في مصفوفة غشاء القاعد. نظرا للاختلافات في معدلات التطوير ، فإن EBs المكاك والريسوس جاهزة للتضمين بالفعل عند 7 dps ، في حين أن EBs البشرية والشمبانزي عادة ما تكون مضمنة في 8-9 dps. من أجل البساطة ، تشير مصفوفة الغشاء القاعدي فقط إلى Matrigel في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن استخدام Geltrex كبديل.
   1. استعدادا للتضمين ، قم بتعقيم المقص بالأشعة فوق البنفسجية ، والملقط ، ورف صغير لأنابيب سعة 0.2 مل ، وثلاثة إلى ستة مربعات من البارافيلم المعالج بنسبة 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول تحت غطاء التدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة. دع مصفوفة الغشاء القاعدي تذوب على الجليد لعدة ساعات (~ 1.5 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي عادة ما تكون كافية ل 96 EBs).
      ملاحظة: احتفظ دائما بمصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد.
   2. قم بإنشاء شبكة غمازة 4 × 4 على parafilm. ضع شبكة parafilm على رف الأنبوب سعة 0.2 مل بحيث يكون الجانب المغلف بالورق متجها لأعلى ، واضغط بإصبع قفاز برفق على كل ثقب في الحامل.
   3. قم بإزالة الورق ، واقطع شبكة الدمل من مربع parafilm باستخدام مقص لضبط حجمه ليناسب طبق زراعة الخلايا 60 مم. ضع البارافيلم المدمل مرة أخرى على رف الأنبوب سعة 0.2 مل لتوفير أساس لتوليد قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي.
   4. باستخدام ماصة ذات طرف ماصة مقطوع 200 ميكرولتر ، قم بنقل EBs بعناية واحدة تلو الأخرى من بئر طبق الاستزراع إلى غمازات parafilm.
   5. بعد نقل 16 EBs إلى الشبكة ، خذ طرف ماصة جديد سعة 200 ميكرولتر ، وقم بإزالة الوسيط المتبقي من الدمامل.
   6. ماصة قطرة واحدة (~ 15 ميكرولتر) من مصفوفة الغشاء القاعدي على كل غمازة تحتوي على EB واحد.
   7. خذ طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر وانقل EBs بسرعة إلى وسط كل قطرة دون الإخلال بحدود القطرات.
   8. ضع البارافيلم المدمل مع قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي في طبق زراعة الخلايا 60 مم ، واحتضانه لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للمصفوفة بالبلمرة.
   9. لفصل EBs المضمنة في المصفوفة من parafilm ، أضف 5 مل من وسط التمايز (DM) بدون فيتامين A ( انظر الجدول 2) إلى الطبق ، واقلب مربع parafilm رأسا على عقب باستخدام ملقط بحيث يكون الجانب مع EBs مواجها الجزء السفلي من الطبق.
   10. هز الطبق بعناية لجعل قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي التي تحتوي على EBs تنفصل عن parafilm. إذا كان بعضها لا يزال متصلا ، خذ حافة مربع parafilm باستخدام ملقط ، وقم بلفها بسرعة نحو وسط الطبق عدة مرات.
   11. استزرع الكائنات العضوية الدماغية على شاكر مداري عند 55 دورة في الدقيقة في جو رطب من 5٪ CO₂ و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية. احتفظ بها في DM بدون فيتامين أ مع تغييرات متوسطة كل يوم. للحث على إنتاج الخلايا العصبية ، قم بالتبديل إلى DM مع فيتامين A (حمض الريتينويك ، RA) بعد 13 dps للعضويات الدماغية marmoset المكاك الريسوس أو 14-15 dps للعضويات الدماغية البشرية والشمبانزي (الشكل 1 أ). من هذه النقطة فصاعدا ، قم بتغيير الوسيط كل 3-4 أيام.
       ملاحظة: لدعم بقاء الخلايا العصبية ، يمكن استكمال DM مع فيتامين A ب 20 ميكروغرام / مل من التغذية العصبية البشرية 3 (NT3) ، و 20 ميكروغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، ومصفوفة الغشاء القاعدي 1 ميكرولتر / مل من 40 dps فصاعدا.

3. التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسيات

ملاحظة: من وجهة نظر فنية ، يمكن إجراء التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية بمجرد أن تكون الهياكل الشبيهة بالبطين واضحة بما يكفي لاستهدافها بالحقن المجهري. تعتمد النافذة الزمنية المثلى للتثقيب الكهربائي على السؤال البيولوجي وعلى مجموعة (مجموعات) الخلايا ذات الأهمية. على سبيل المثال ، إذا كانت السلف القمي (APs) هي الهدف الرئيسي ، فإن الكائنات العضوية الدماغية عند حوالي 30 dps مناسبة بالفعل. إذا كانت الأسلاف القاعدية (BPs) أو الخلايا العصبية هي الأهداف الرئيسية ، فيجب استخدام عضويات دماغية أقدم تزيد عن 50 dps (انظر ، على سبيل المثال ، Fischer et ^al.28).

1. إعداد الإعداد الكهربائي
   ملاحظة: تتأثر كفاءة التثقيب الكهربائي بشدة بحجم وتركيز البلازميد (البلازميدات) المكهربة (انظر قسم المناقشة للحصول على التفاصيل).
   1. قم بإعداد كمية كافية من مزيج التثقيب الكهربائي للتحكم والجين محل الاهتمام (GOI) ، على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر من مزيج التثقيب الكهربائي لكل عنصر تحكم و GOI لتوليد ما يقرب من 30 عضويا دماغيا لكل حالة.
      ملاحظة: لمعرفة تركيبة خلطات التثقيب الكهربائي، انظر الجدول 3.
   2. Prewarm (غير معقمة) خليط النسر المعدل / المغذيات من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) و DM مع فيتامين A إلى 37 درجة مئوية. قم بإعداد ملعقة صغيرة ومقص ناعم وعادي ، ورش الأدوات بنسبة 70٪ (حجم / حجم).
      ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية إما في ظروف معقمة أو غير معقمة لأن DM يحتوي على مضادات حيوية (انظر الجدول 2). في تجربتنا ، لم يتسبب غياب العقم في أي تلوث.
   3. قم بإعداد أطباق زراعة الخلايا 35 مم ، وقم بتوصيل غرفة قطب طبق بتري بالكهرباء.
      ملاحظة: غرف قطب طبق بتري متوفرة تجاريا. ومع ذلك ، يمكن إنتاجها بسهولة بطريقة فعالة من حيث التكلفة (انظر الملف التكميلي 1).
   4. باستخدام أطراف اللودر الدقيق ، املأ إبر الحقن المجهري ب 8 ميكرولتر من كل مزيج من مزيج التثقيب الكهربائي. قطع أطراف الإبر باستخدام مقص دقيق قبل الاستخدام الأول لتحقيق تدفق مستقر. ومع ذلك ، قم بإزالة جزء صغير فقط من الحافة ، لأن الطرف الحاد والعريض يمكن أن يلحق أضرارا بالغة بالمواد العضوية.
      ملاحظة: إبر الحقن المجهري إما متاحة تجاريا كإبر حقن مجهرية مسحوبة مسبقا أو يمكن سحبها في المختبر إذا كان مجتذب الإبرة متاحا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لمجتذب الإبرة لإنشاء إبر حقن مجهرية ذات استدقاق طويل وقطر طرف 10 ميكرومتر.
2. الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي
   1. تحت المجهر ، اختر خمسة عضويات دماغية ذات حدود ناعمة وهياكل تشبه البطين واضحة للعيان. انقلها إلى طبق زراعة الخلايا 35 مم يحتوي على DMEM / F12 مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) باستخدام طرف ماصة مقطوع 1000 ميكرولتر.
      ملاحظة: اختر عضويات دماغية ذات هياكل تشبه البطين واضحة ويمكن الوصول إليها (انظر الشكل 1 ب).
   2. لحقن بنية تشبه البطين ، أدخل الإبرة بعناية من خلال جدارها ، وغمرها بمزيج التثقيب الكهربائي حتى تمتلئ بشكل واضح. لا تضغط بشكل مفرط على الهياكل الشبيهة بالبطين لتجنب انفجارها. المضي قدما مع ستة إلى ثمانية هياكل تشبه البطين من كل عضو دماغي بهذه الطريقة.
      ملاحظة: إذا انسدادت الإبرة أثناء عملية الحقن المجهري ، فيجب قطع الطرف قليلا.
   3. انقل عضويا دماغيا محقونا بالحقن الدقيق إلى حجرة قطب طبق بتري بكمية صغيرة من DMEM / F12. رتب العضو العضوي بطريقة تواجهها أسطح الهياكل الشبيهة بالبطين المحقونة الدقيقة باتجاه القطب المتصل بالقطب الموجب للجهاز الكهربي.
      ملاحظة: يضمن توجيه الهياكل بهذه الطريقة نقل الخلايا على جانب الهيكل الشبيه بالبطين الذي لا يتأثر بالهيكل المجاور.
   4. قم بإلكتروبور العضويات الدماغية واحدة تلو الأخرى باستخدام الإعدادات التالية: 5 نبضات 80 فولت ، ومدة النبض 50 مللي ثانية ، وفاصل 1 ثانية. انقل المواد العضوية المكهربة إلى طبق جديد لزراعة الخلايا مقاس 35 مم مملوء ب DMEM / F12 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
      ملاحظة: قد تعتمد إعدادات التثقيب الكهربائي على جهاز التثقيب الكهربائي ذو الموجة المربعة المتوفر. تم تحسين هذه الإعدادات لنظام التثقيب الكهربائي المشار إليه. زيادة الجهد يمكن أن يؤدي إلى إزاحة الخلايا.
   5. تابع بنفس الطريقة مع المواد العضوية الدماغية الخمسة التالية باستخدام مزيج التثقيب الكهربائي الثاني (على سبيل المثال ، GOI).
      ملاحظة: كرر الخطوات 3.2.1-3.2.5 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من العضويات الدماغية المكهربة.
   6. إذا تم إجراء الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي في ظل ظروف غير معقمة ، فقم بنقل المواد العضوية الكهربائية إلى طبق زراعة خلية معقم 35 مم تحت غطاء تدفق رقائقي أثناء نقل أقل قدر ممكن من DMEM / F12 إلى طبق زراعة الخلايا الجديد.
3. مزيد من الثقافة وتثبيت المواد العضوية الدماغية
   1. استزرع الكائنات العضوية المكهربة في DM مع فيتامين A على شاكر مداري عند 55 دورة في الدقيقة في جو رطب من 5٪ CO₂ و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية.
   2. في اليوم التالي بعد التثقيب الكهربائي ، تحقق من المواد العضوية الدماغية بحثا عن التثقيب الكهربائي الناجح تحت مجهر مضان تقليدي مقلوب.
      ملاحظة: اعتمادا على طول المزرعة الإضافية بعد التثقيب الكهربائي ، تتأثر مجموعات الخلايا المختلفة داخل العضو الدماغي (انظر أيضا قسم النتائج التمثيلية).
   3. المضي قدما في التطبيقات النهائية بعد زراعة العضويات الدماغية الكهربائية لفترة من الوقت مناسبة للمسألة البيولوجية ذات الأهمية.
      ملاحظة: يمكن معالجة العضويات الدماغية المكهربة لتطبيقات مختلفة في المراحل النهائية (على سبيل المثال ، التثبيت لتلطيخ التألق المناعي أو التجميد المفاجئ لعزل الحمض النووي الريبي و qRT-PCR). هنا ، نصف تثبيت العضويات الدماغية المكهربة.
   4. انقل المواد العضوية المكهربة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 1000 ميكرولتر ، وقم بإزالة الوسط الزائد.
   5. أضف كمية كافية من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في DPBS (درجة الحموضة 7.5) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: يصنف PFA على أنه مادة مسرطنة للإنسان وقد يتسبب في أضرار صحية لا يمكن إصلاحها. يوصى بشدة باتخاذ تدابير احترازية إضافية بما في ذلك قفازات النتريل والنظارات الواقية.
   6. نضح PFA ، أضف 5 مل من DPBS ، اهتز قليلا ، واستنشق DPBS. كرر هذا 2x. قم بتخزين المواد العضوية في DPBS على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، حيث يمكن تخزين العضويات الدماغية الثابتة PFA عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر. يمكن تحليل المواد العضوية الكهربائية الثابتة PFA عن طريق التشريح بالتبريد وتلطيخ التألق المناعي ^10,28 أو عن طريق تلطيخ ومسح ^35,36 بالكامل. على سبيل المثال الصور، راجع قسم النتائج التمثيلية (انظر الجدول 4 للحصول على تفاصيل الأجسام المضادة).

النتائج

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بالتوليد الفعال للعضويات الدماغية من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس وخطوط iPSC الشائعة مع الحد الأدنى من تغييرات التوقيت المطلوبة بين الأنواع (الشكل 1 أ). يمكن تزويد هذه الكائنات العضوية بالكهرباء في حدود 20 dps إلى 50 dps ، اعتمادا على إمكانية الو?...

Discussion

تمثل الإجراءات الموصوفة هنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من أنواع رئيسية مختلفة مع نهج التثقيب الكهربائي المستهدف. وهذا يسمح بالتعبير خارج الرحم لحكومة إسرائيل في نظام نموذجي يحاكي تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (بما في ذلك الإنسان) (المرضي). يستخدم هذا البروتو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305