Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética

Resumen

La electroporación de organoides cerebrales de primates proporciona un enfoque preciso y eficiente para introducir modificaciones genéticas transitorias en diferentes tipos de progenitores y neuronas en un sistema modelo cercano al desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de primates. Esto permite el estudio de los procesos evolutivos y del desarrollo neurológico y también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Resumen

La corteza cerebral es la estructura cerebral más externa y es responsable del procesamiento de la entrada sensorial y la salida motora; Es visto como el asiento de las capacidades cognitivas de orden superior en los mamíferos, en particular, los primates. El estudio de las funciones genéticas en los cerebros de los primates es un desafío debido a razones técnicas y éticas, pero el establecimiento de la tecnología de organoides cerebrales ha permitido el estudio del desarrollo del cerebro en modelos tradicionales de primates (por ejemplo, macaco rhesus y tití común), así como en especies de primates previamente inaccesibles experimentalmente (por ejemplo, grandes simios), en un sistema éticamente justificable y menos exigente técnicamente. Además, los organoides cerebrales humanos permiten la investigación avanzada de trastornos neurológicos y del neurodesarrollo.

A medida que los organoides cerebrales recapitulan muchos procesos del desarrollo cerebral, también representan una herramienta poderosa para identificar diferencias y comparar funcionalmente los determinantes genéticos subyacentes al desarrollo cerebral de varias especies en un contexto evolutivo. Una gran ventaja del uso de organoides es la posibilidad de introducir modificaciones genéticas, lo que permite probar las funciones de los genes. Sin embargo, la introducción de tales modificaciones es laboriosa y costosa. Este documento describe un enfoque rápido y rentable para modificar genéticamente las poblaciones celulares dentro de las estructuras ventriculares de los organoides cerebrales de primates, un subtipo de organoides cerebrales. Este método combina un protocolo modificado para la generación confiable de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de titíes humanos, chimpancés, macacos rhesus y comunes con un enfoque de microinyección y electroporación. Esto proporciona una herramienta eficaz para el estudio de los procesos de desarrollo neurológico y evolutivo que también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Introducción

Investigar el desarrollo (pato)fisiológico y la evolución de la corteza cerebral es una tarea formidable que se ve obstaculizada por la falta de sistemas modelo adecuados. Anteriormente, tales estudios se limitaban a modelos de cultivo celular bidimensionales (como progenitores neurales primarios o cultivos de células neuronales) y modelos animales evolutivamente distantes (como roedores)^1,2. Si bien estos modelos son útiles para abordar ciertas preguntas, están limitados para modelar la complejidad, la composición del tipo de célula, la arquitectura celular y los patrones de expresión génica del neocórtex hum....

Protocolo

1. Cultivo de iPSCs de primates

NOTA: Debido a su robustez, el método presentado aquí se puede aplicar a cualquier línea iPSC de primates. En este artículo, describimos la producción de organoides cerebrales a partir de líneas humanas (iLonza2.2)29, chimpancés (Sandra A)³⁰, macacos rhesus (iRh33.1)²⁹ y tití común (cj_160419_5)³¹ iPSC. Las condiciones de cultivo se resumen en la Tabla 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos ....

Discusión

Los procedimientos descritos aquí representan un protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de diferentes especies de primates con un enfoque de electroporación dirigido. Esto permite la expresión ectópica de un GOI en un sistema modelo que emula el desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de los primates (incluido el humano). Este protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de primates utiliza los mismos materiales (por ejemplo, medios) y pasos de protocolo para las cua.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305