Таргетная микроинъекция и электропорация церебральных органоидов приматов для генетической модификации

Резюме

Электропорация церебральных органоидов приматов обеспечивает точный и эффективный подход к введению переходных генетических модификаций в различные типы предшественников и нейронов в модельной системе, близкой к (пато)физиологическому развитию неокортекса приматов. Это позволяет изучать процессы развития нервной системы и эволюционные процессы, а также может быть применено для моделирования заболеваний.

Аннотация

Кора головного мозга является самой внешней структурой мозга и отвечает за обработку сенсорного ввода и моторного выхода; Он рассматривается как место когнитивных способностей более высокого порядка у млекопитающих, в частности, приматов. Изучение функций генов в мозге приматов является сложной задачей по техническим и этическим причинам, но создание технологии органоидов мозга позволило изучить развитие мозга в традиционных моделях приматов (например, макаки-резуса и обыкновенной мартышки), а также у ранее экспериментально недоступных видов приматов (например, человекообразных обезьян) в этически оправданной и менее технически сложной системе. Кроме того, органоиды человеческого мозга позволяют проводить расширенные исследования нервно-психических и неврологических расстройств.

Поскольку органоиды мозга повторяют многие процессы развития мозга, они также представляют собой мощный инструмент для выявления различий и функционального сравнения генетических детерминант, лежащих в основе развития мозга различных видов в эволюционном контексте. Большим преимуществом использования органоидов является возможность введения генетических модификаций, что позволяет тестировать функции генов. Однако внедрение таких модификаций является трудоемким и дорогостоящим. В этой статье описывается быстрый и экономически эффективный подход к генетической модификации клеточных популяций в желудочкоподобных структурах церебральных органоидов приматов, подтипа органоидов мозга. Этот метод сочетает в себе модифицированный протокол для надежной генерации церебральных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека, шимпанзе, макак-резуса и обыкновенной мартышки с микроинъекционным и электропорационным подходом. Это обеспечивает эффективный инструмент для изучения процессов развития нервной системы и эволюции, который также может быть применен для моделирования заболеваний.

Введение

Исследование (пато)физиологического развития и эволюции коры головного мозга является сложной задачей, которая затрудняется отсутствием подходящих модельных систем. Ранее такие исследования ограничивались двумерными моделями клеточных культур (таких как первичный нейронный предшественник или культуры нейрональных клеток) и эволюционно удаленными моделями животных (таких как грызуны)^1,2. Хотя эти модели полезны для решения определенных вопросов, они ограничены в моделировании сложности, состава типа клеток, клеточной архитектуры и паттернов экспрессии генов развивающегося неокортекса человека в здоровом и болез....

протокол

1. Культура ИПСК приматов

ПРИМЕЧАНИЕ: Благодаря своей надежности представленный здесь метод может быть применен к любой линии iPSC приматов. В этой статье мы описываем продукцию церебральных органоидов из линий iPSC человека (iLonza2.2)29, шимпанзе (Sandra A)³⁰, макаки-резуса (iRh33.1)²⁹ и обыкновенной мартышки (cj_160419_5)³¹. Условия культивирования приведены в таблице 1. Подробную информацию обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов.

Результаты

Описанный здесь протокол позволяет эффективно генерировать церебральные органоиды из линий iPSC человека, шимпанзе, макаки-резуса и обыкновенной мартышки с минимальными временными изменениями, необходимыми между видами (рис. 1A). Эти органоиды могут быть электропорирова.......

Обсуждение

Описанные здесь процедуры представляют собой унифицированный протокол генерации церебральных органоидов от разных видов приматов с целевым электропорационным подходом. Это позволяет эктопическую экспрессию ГОИ в модельной системе, которая имитирует (в том числе человека) (пато)физи.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305