Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.

Abstract

קליפת המוח היא מבנה המוח החיצוני ביותר והיא אחראית על עיבוד הקלט החושי והפלט המוטורי; הוא נתפס כמקום מושבן של יכולות קוגניטיביות מסדר גבוה יותר אצל יונקים, במיוחד פרימטים. חקר תפקודי גנים במוחות של פרימטים הוא מאתגר מסיבות טכניות ואתיות, אך הקמת טכנולוגיית אורגנואיד המוח אפשרה לחקור את התפתחות המוח במודלים מסורתיים של פרימטים (למשל, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי), כמו גם במינים של פרימטים שלא היו נגישים בעבר בניסוי (למשל, קופי אדם גדולים), במערכת מוצדקת מבחינה אתית ופחות תובענית מבחינה טכנית. יתר על כן, אורגנואידים במוח האנושי מאפשרים חקירה מתקדמת של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירולוגיות.

מאחר שאורגנואידים במוח משחזרים תהליכים רבים של התפתחות המוח, הם גם מהווים כלי רב-עוצמה לזיהוי הבדלים ולהשוואה תפקודית בין הגורמים הגנטיים העומדים בבסיס התפתחות המוח של מינים שונים בהקשר אבולוציוני. יתרון גדול של שימוש באורגנואידים הוא האפשרות להכניס שינויים גנטיים, המאפשרים בדיקה של תפקודי גנים. עם זאת, המבוא של שינויים כאלה הוא מייגע ויקר. מאמר זה מתאר גישה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של אוכלוסיות תאים בתוך מבנים דמויי חדרים של אורגנואידים מוחיים של פרימטים, תת-סוג של אורגנואידים במוח. שיטה זו משלבת פרוטוקול שונה לייצור אמין של אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם במרמוסט ונפוצים שמקורם במרמוסט עם גישת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. זה מספק כלי יעיל לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים שניתן ליישם גם עבור מודלים של מחלות.

Introduction

חקירת ההתפתחות והאבולוציה הפיזיולוגית (הפתולוגית) של קליפת המוח היא משימה אימתנית שמתעכבת על ידי היעדר מערכות מודל מתאימות. בעבר, מחקרים כאלה היו מוגבלים למודלים דו-ממדיים של תרביות תאים (כגון אב עצבי ראשוני או תרביות תאים עצביים) ולמודלים אבולוציוניים רחוקים של בעלי חיים (כגון מכרסמים)1,2. בעוד מודלים אלה שימושיים להתמודדות עם שאלות מסוימות, הם מוגבלים במידול המורכבות, הרכב סוג התא, הארכיטקטורה התאית ודפוסי ביטוי הגנים של הניאוקורטקס האנושי המתפתח במצבים בריאים וחולים. מגבלות אלה מובילות, למשל, ליכולת תרגום ירודה של מודלים עכבריים של מחלות אנושיות למצב האנושי, כפי שמתואר במקרים מסוימים של מיקרוצפליה (למשל, Zhang et al.3). לאחרונה, פרימטים טרנסגניים שאינם אנושיים, שהם מודל קרוב יותר מבחינה אבולוציונית, תפקודית ומורפולוגית של התפתחות הניאו-קורטקס האנושי, נכנסו למוקד 4,5,6,7,8 כשהם מתגברים על מגבלות רבות של מודלים מבוססי תרביות תאים ומכרסמים. עם זאת, השימוש בפרימטים לא אנושיים במחקר הוא לא רק יקר מאוד וגוזל זמן רב, אלא גם מעלה חששות אתיים. לאחרונה, הפיתוח של טכנולוגיית אורגנואיד המוח 9,10 התגלה כחלופה מבטיחה שפותרת רבות מהמגבלות של מודלים קודמים 11,12,13,14,15,16.

אורגנואידים במוח הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), רב-תאיים המחקים את המאפיינים העיקריים של הציטוארכיטקטורה והרכב התא של אזור מוח אחד או יותר עבור חלון זמן התפתחותי מוגדר 11,12,13,14,17. מבנים תלת-ממדיים אלה נוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או, אם הם זמינים עבור המינים המעניינים, מתאי גזע עובריים (ESC). באופן כללי, ניתן להבחין בין שני סוגים של אורגנואידים במוח בהתבסס על המתודולוגיה בה נעשה שימוש: אורגנואידים במוח לא מונחים ואזוריים (מונחים)18. ביצירת הסוג השני של אורגנואידים, מולקולות קטנות או גורמים מסופקים המנחים את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לאורגנואידים של אזור מוח מסוים (למשל, אורגנואידים במוח הקדמי)18. לעומת זאת, באורגנואידים לא מונחים, ההתמיינות אינה מונחית על ידי תוספת של מולקולות קטנות אלא מסתמכת אך ורק על התמיינות ספונטנית של iPSCs/ESCs. האורגנואידים במוח המתקבלים מורכבים מסוגי תאים המייצגים אזורי מוח שונים (למשל, אורגנואידים מוחיים)18. אורגנואידים במוח משלבים תכונות מפתח רבות של התפתחות המוח עם ייצור חסכוני יחסית וחסכוני בזמן מכל מין של עניין שעבורו iPSCs או תאי גזע עובריים מושרים זמינים11,12,13,14. זה הופך אורגנואידים במוח למודל מצוין עבור סוגים רבים של מחקרים נוירוביולוגיים, החל משאלות אבולוציוניות והתפתחותיות ועד מודלים של מחלות ובדיקות סמים15,16. עם זאת, מענה לשאלות כאלה באמצעות אורגנואידים במוח תלוי מאוד בזמינות של שיטות שונות לשינוי גנטי.

היבט מרכזי אחד של חקר ההתפתחות הפיזיולוגית של ניאו-קורטקס (פתו) והאבולוציה שלה הוא ניתוח פונקציונלי של גנים וגרסאות גנים. זה מושג בדרך כלל על ידי ביטוי (חוץ רחמי) ו / או על ידי דפיקה (KD) או נוק-אאוט (KO) של גנים אלה. שינויים גנטיים כאלה יכולים להיות מסווגים לשינוי גנטי יציב וחולף, כמו גם לשינויים להיות מוגבל זמנית ומרחבית או לא מוגבל. שינוי גנטי יציב מוגדר על ידי הכנסת שינוי גנטי לגנום המארח המועבר לכל דורות התא הבאים. בהתאם לנקודת הזמן של שינוי גנטי, זה יכול להשפיע על כל התאים של אורגנואיד או יכול להיות מוגבל לאוכלוסיות תאים מסוימות. לרוב, שינוי גנטי יציב מושג באורגנואידים במוח ברמת iPSC/ESC על ידי יישום לנטי-וירוסים, מערכות דמויות טרנספוזון וטכנולוגיית CRISPR/Cas9 (נבדקו על-ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 ו-Teriyapirom et al.20). יש לכך יתרון בכך שכל תאי האורגנואיד במוח נושאים את השינוי הגנטי וכי הוא אינו מוגבל זמנית או מרחבית. עם זאת, הייצור והאפיון של קווי iPSC/ESC יציבים אלה גוזלים זמן רב, ולעתים קרובות לוקח מספר חודשים עד שניתן לנתח את אורגנואידי המוח הראשונים ששונו (נבדקו על ידי למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, or Teriyapirom et al.20).

לעומת זאת, שינוי גנטי חולף מוגדר על ידי העברת מטען גנטי (למשל, פלסמיד ביטוי גנים) שאינו משתלב בגנום המאכסן. בעוד ששינוי זה יכול, באופן עקרוני, להיות מועבר לדורות התא הבאים, המטען הגנטי המועבר ידולל בהדרגה עם כל חלוקת תא. לכן, סוג זה של שינוי גנטי מוגבל בדרך כלל באופן זמני ומרחבי. שינוי גנטי חולף יכול להתבצע באורגנואידים במוח על ידי וירוסים הקשורים באדנו או על ידי אלקטרופורציה (נבדק על ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, ו Teriyapirom et al.20), כאשר האחרון מתואר בפירוט במאמר זה. בניגוד לשינוי גנטי יציב, גישה זו היא מהירה מאוד וחסכונית. אכן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בתוך דקות, ובהתאם לאוכלוסיית תאי היעד, אורגנואידים מחושמלים מוכנים לניתוח תוך ימים (נבדקו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et al.19). עם זאת, שינויים מורפולוגיים גסים של אורגנואיד המוח, כגון הבדלים בגודל, לא ניתן לזהות באמצעות שיטה זו, כמו סוג זה של שינוי גנטי מוגבל באופן זמני ומרחבי. הגבלה זו יכולה להיות גם יתרון, למשל, במקרה של חקר אוכלוסיות תאים בודדות בתוך האורגנואיד או ההשפעות על אורגנואידים במוח בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות (שנסקרו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et al.19).

גישה קלאסית לחקר תפקוד גנים במהלך התפתחות המוח והאבולוציה היא אלקטרופורציה ברחם. ברחם אלקטרופורציה היא טכניקה ידועה ושימושית להעברת מבני ביטוי גנים למוחות מכרסמים 21,22,23 וחמוס24,25. ראשית, תמיסה המכילה את מבני הביטוי המעניינים מוזרקת במיקרו דרך דופן הרחם לחדר מסוים במוח העוברי, בהתאם לאזור שיש להתמקד בו. בשלב השני, פולסים חשמליים מוחלים כדי להדביק את התאים ישירות רירית החדר הממוקד. גישה זו אינה מוגבלת רק לביטוי חוץ רחמי או ביטוי יתר של גנים, כפי שהיא יכולה להיות מיושמת גם במחקרי KD או KO על ידי הזרקה זעירה של סיכת שיער קצרה (shRNA) או CRISPR/Cas9 (בצורה של פלסמידים ביטוי או ריבונוקלאו פרוטאינים [RNPs]), בהתאמה26,27. עם זאת, לאלקטרופורציה ברחם של עוברי עכבר, חולדה וחמוס יש את אותן מגבלות שתוארו לעיל עבור מודלים אלה של בעלי חיים.

באופן אידיאלי, אחד רוצה לבצע אלקטרופורציה הרחם ישירות פרימטים. בעוד שבאופן עקרוני זה אפשרי מבחינה טכנית, ברחם אלקטרופורציה אינה מתבצעת בפרימטים בשל חששות אתיים, עלויות תחזוקה גבוהות של בעלי חיים וגודל המלטה קטן. עבור פרימטים מסוימים, כגון קופים גדולים (כולל בני אדם), זה לא אפשרי בכלל. עם זאת, לפרימטים אלה יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) האנושי והאבולוציה שלו. פתרון אחד לדילמה זו הוא ליישם את טכניקת האלקטרופורציה על אורגנואידים במוח פרימטים28.

מאמר זה מציג פרוטוקול לאלקטרופורציה של תת-סוג של אורגנואידים במוח פרימטים, אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו מאפשרת שינוי גנטי מהיר וחסכוני של אוכלוסיות תאים בתוך המבנים דמויי החדרים של האורגנואידים. באופן ספציפי, אנו מתארים פרוטוקול מאוחד ליצירת אורגנואידים מוחיים פרימטים מבני אדם (הומו ספיינס), שימפנזה (Pan troglodytes), מקוק רזוס (Macaca mulatta) ומרמוסט מצוי (Callithrix jacchus) iPSCs. יתר על כן, אנו מתארים בפירוט את טכניקת המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה ומספקים קריטריונים של "ללכת" ו"לא-ללכת" לביצוע אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו היא כלי יעיל לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) והתפתחותו במודל קרוב במיוחד למצב האנושי.

Protocol

1. תרבית של פרימטים מושרים

הערה: בשל החוסן שלה, השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על כל קו iPSC פרימטים. במאמר זה אנו מתארים ייצור אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים (iLonza2.2)29, שימפנזים (Sandra A)30, מקוק רזוס (iRh33.1)29 ומרמוסט מצוי (cj_160419_5)31 קווי iPSC. תנאי התרבות מסוכמים בטבלה 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. לטיפוח תאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים (iPSC) המתאימים, עקבו אחר תנאי התרבות המתוארים במקור. באופן כללי, ליצירה מוצלחת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים, השתמש בקווי iPSC שלא תורבתו במשך יותר מ -90 מעברים. בנוסף, בתחילת ייצור אורגנואידים מוחיים, יש לוודא כי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מציגים תכונות של פלוריפוטנציה ללא סימני הבחנה.

2. יצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של פרימטים

הערה: הפרוטוקול ליצירת אורגנואידים מוחיים מבוסס על גרסה שונה 28,30,32,33 של פרוטוקול אורגנואיד מוחי מקורי 10,34 עם כמה שינויים ספציפיים למין (מפורט להלן).

  1. זריעה של iPSCs ליצירת גופים עובריים (EBs)
    1. לאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 80%-90%, שטפו אותם במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco, והוסיפו 500 מיקרוליטר של תחליף טריפסין רקומביננטי או 1 מ"ל של תערובת פרוטאוליטית וקולגנוליטית.
      הערה: בדרך כלל, iPSCs מתורבתים בצלחת תרבית תאים 60 מ"מ כדי לקבל כ 900,000 תאים, וזה מספיק כדי לייצר 96 אורגנואידים מוחיים. ניתן להתאים את מספרי התאים בהתאם למספר האורגנואידים הדרושים. שימו לב שלא כל האורגנואידים המוחיים שנוצרו עשויים להתאים להתחשמלות.
    2. לדגור על צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות כדי לנתק את התאים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בעד 2 דקות נוספות של דגירה ב-37°C, בהתאם לקו iPSC או לאנזים שבו נעשה שימוש. מומלץ לבחון את התבשיל תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים החלו להתנתק.
    3. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש (37 ° C) כדי לעצור את התגובה, ופיפטה למעלה ולמטה 7x-10x (לא יותר מ 10x) כדי לנתק את התאים מצלחת תרבית התא ולקבל תרחיף תא יחיד.
    4. מעבירים את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגות את התאים ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שאפו את הסופר-נטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיום תרבית iPSC בתוספת תרכובת תומכת הישרדות של 50 מיקרומטר Y27632 או 50 מיקרומטר.
    6. השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את התאים באמצעות תא נויבאואר.
    7. התאימו את תרחיף התאים לריכוז של 9,000 תאים לכל 150 מיקרוליטר (60,000 תאים/מ"ל) באמצעות תרבית iPSC בתוספת 50 מיקרומטר Y27632 או 50 מיקרומטר תרכובת פרו-הישרדותית.
    8. כדי ליצור גופים עובריים (EBs), זרעו 150 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של צלחת חיבור 96 באר נמוכה במיוחד. תוך כדי פיפטינג, נערו בעדינות את הצינור המכיל את תרחיף התא כדי למנוע מהתאים לשקוע.
    9. תרבית את ה- EBs באטמוספירה הוחה של 5% CO2 ו- 95% אוויר ב- 37 ° C (0 ימים לאחר הזריעה [dps]). אין להפריע ל-EBs במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הזריעה.
      הערה: EBs המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במרמוסט צריכים להיות מתורבתים באטמוספירה הוחה בתנאים היפוקסיים (5% CO 2, 5% O 2 ו-90% N 2) בטמפרטורה של 37°C.
    10. לאחר ~48 שעות (2 dps), שנה את המדיום למדיום תרבית iPSC ללא תרכובת Y27632/pro-survival. מוציאים 100 μL בינוני לכל באר, ומוסיפים 150 μL של מדיום טרי שחומם מראש (37°C) ללא Y27632. עבור שורה אחר שורה.
    11. לבצע שינויים בינוניים נוספים כל יומיים; הסירו 150 מיקרוליטר מדיום מכל באר, והוסיפו 150 מיקרוליטר של מדיום טרי שחומם מראש (37°C) ללא תרכובת Y27632/פרו-הישרדות לכל באר.
      הערה: לאחר 4-5 dps, הפריפריה של EBs צריכה להיות שקופה.
  2. אינדוקציה של neuroectoderm
    הערה: באופן כללי, EBs באיכות טובה צריכים להיות בעלי קווי מתאר חלקים וגבולות שקופים בשלב זה. נקודות הזמן של אינדוקציה עצבית שונות מעט בין מיני פרימטים לבין קווי iPSC. במקרה של קווי התאים המשמשים כאן (ראו סעיף 1 וטבלת החומרים), אינדוקציה עצבית עבור EBs מרמוסט בדרך כלל צריכה להתחיל ב-4 dps, עבור rhesus macaque ב-5 dps, ועבור EBs אנושיים ושימפנזים ב-4-5 dps (איור 1A), בהתאם למצב EBs (ראו לעיל).
    1. הסר 150 μL של מדיום מכל באר בשורה הראשונה של לוח 96 הקידוחים, והוסף 150 μL של תווך אינדוקציה עצבית שחומם מראש (37 ° C) (ראה טבלה 2) לכל באר באותה שורה.
    2. המשך לשנות את המדיום כמתואר לעיל שורה אחר שורה עבור כל הלוח בן 96 הקידוחים. בצע שינויים נוספים בתווך אינדוקציה עצבית (NIM) כל יומיים על ידי הסרת 150 μL של NIM מכל באר והוספת 150 μL של NIM טרי שחומם מראש (37 ° C).
      הערה: מנקודה זו ואילך, יש לתרבית את המרמוסטים EBs באותם תנאים כמו הפרימטים EBs האחרים (אטמוספירה הוחה של 5% CO2 ו-95% אוויר ב-37°C).
  3. הטבעה במטריצת קרום מרתף
    הערה: לאחר שה- EBs פיתחו נוירואפיתל בולט, שקוף ומאורגן רדיאלית על פני השטח, יש לספק תמיכה מבנית לפיתוח מבנים דמויי חדרים. זה מושג על ידי הטבעה EBs לתוך מטריצה קרום מרתף. בשל הבדלים בקצב הפיתוח, EBs של מקוק מרמוסט ורזוס מוכנים להטמעה כבר ב- 7 dps, בעוד EBs אנושיים ושימפנזים מוטמעים בדרך כלל ב- 8-9 dps. לשם הפשטות, מטריצת קרום מרתף מתייחסת רק למטריג'ל בפרוטוקול זה. עם זאת, Geltrex יכול לשמש כתחליף.
    1. כהכנה להטמעה, מספריים מעקרים UV, מלקחיים, מתלה קטן עבור צינורות 0.2 מ"ל, ושלושה עד שישה ריבועים של פרפילם מטופלים עם אתנול 70% (vol/vol) מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית במשך 15 דקות. תנו למטריצת קרום המרתף להפשיר על קרח במשך מספר שעות (~ 1.5 מ"ל של מטריצת קרום מרתף מספיקה בדרך כלל ל 96 EBs).
      הערה: שמור תמיד את מטריצת קרום המרתף על קרח.
    2. צור רשת של 4 x 4 גומות על הפרפילם. הניחו את רשת הפרפילם על מדף הצינור בנפח 0.2 מ"ל כך שהצד העטוף בנייר פונה כלפי מעלה, ולחצו בעדינות אצבע בכפפה על כל חור בארון התקשורת.
    3. הסר את הנייר, וחתך את רשת הגומה מתוך ריבוע הפרפילם באמצעות מספריים כדי להתאים את גודלו כך שיתאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. החזירו את הפרפילם השמוט למדף הצינור בנפח 0.2 מ"ל כדי לספק בסיס ליצירת טיפות מטריצת קרום המרתף.
    4. בעזרת פיפטה עם קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר, מעבירים בזהירות את ה-EBs בזה אחר זה מהבאר של צלחת התרבית לגומות הפרפילם.
    5. לאחר העברת 16 EBs לרשת, קח קצה פיפטה חדש של 200 μL, והסר את התווך שנותר מהגומות.
    6. פיפטה טיפה אחת (~ 15 μL) של מטריצת קרום מרתף על כל גומה המכילה EB אחד.
    7. קח קצה פיפטה של 10 μL והזז במהירות את ה- EBs למרכז כל טיפה מבלי להפריע לגבולות הטיפה.
    8. מניחים את הפרפילם הפצוע עם טיפות מטריצת קרום המרתף בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ, ודגרים במשך 15-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצה להתפלמר.
    9. כדי לנתק את ה-EBs המשובצים במטריצה מהפרפילם, הוסיפו 5 מ"ל של מדיום התמיינות (DM) ללא ויטמין A לצלחת, והפכו את ריבוע הפרפילם הפוך באמצעות מלקחיים, כך שהצד עם ה-EBs פונה לתחתית המנה.
    10. נערו בזהירות את הכלי כדי לגרום לטיפות מטריצת קרום המרתף המכילות את ה- EBs להתנתק מהפרפילם. אם חלקם עדיין מחוברים, קחו קצה של ריבוע הפרפילם באמצעות מלקחיים, וגלגלו אותו במהירות כלפי מעלה לכיוון מרכז המנה מספר פעמים.
    11. תרבית את האורגנואידים המוחיים על שייקר מסלול ב 55 סל"ד באטמוספירה לח של 5% CO2 ו 95% אוויר ב 37 ° C. שמור אותם DM ללא ויטמין A עם שינויים בינוניים כל יומיים. כדי לגרום לייצור תאי עצב, עברו ל-DM עם ויטמין A (חומצה רטינואית, RA) לאחר 13 dps עבור אורגנואידים מוחיים של מרמוסט ורזוס מקוק, או 14-15 dps עבור אורגנואידים מוחיים אנושיים ושימפנזים (איור 1A). מנקודה זו ואילך, לשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
      הערה: כדי לתמוך בהישרדות עצבית, ניתן להוסיף DM עם ויטמין A עם 20 מיקרוגרם/מ"ל נוירוטרופין אנושי 3 (NT3), 20 מיקרוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), ומטריצת קרום מרתף 1 μL/מ"ל מ-40 dps ואילך.

3. אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים

הערה: מנקודת מבט טכנית, אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים יכולה להתבצע ברגע שהמבנים דמויי החדר בולטים מספיק כדי להיות ממוקדים על ידי מיקרו-הזרקה. חלון הזמן האופטימלי להתחשמלות תלוי בשאלה הביולוגית ובאוכלוסיות התאים המעניינות. לדוגמה, אם אבות אפיים (APs) הם המטרה העיקרית, אז אורגנואידים מוחיים בסביבות 30 dps כבר מתאימים. אם אבות בסיסיים (BPs) או נוירונים הם המטרות העיקריות, יש להשתמש באורגנואידים מוחיים ישנים יותר של יותר מ -50 dps (ראה, למשל, Fischer et al.28).

  1. הכנת מערך האלקטרופורציה
    הערה: יעילות האלקטרופורציה מושפעת מאוד מהגודל והריכוז של הפלסמיד(ים) המחושמלים (ראה פירוט בסעיף הדיון).
    1. הכינו כמות מספקת של תערובת אלקטרופורציה עבור הבקרה וגן העניין (GOI), לדוגמה, 10 מיקרוליטר של תערובת אלקטרופורציה עבור כל בקרה, ו- GOI כדי לחשמל כ -30 אורגנואידים מוחיים לכל מצב.
      הערה: להרכב תערובות האלקטרופורציה, ראה טבלה 3.
    2. Prewarm (לא סטרילי) תערובת Dulbecco מדיום/מזין של Dulbecco F-12 (DMEM/F12) ו-DM עם ויטמין A עד 37°C. הכינו מרית קטנה ומספריים עדינים ורגילים, ורססו את המכשירים באתנול 70% (vol/vol).
      הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים או לא סטריליים מכיוון שה- DM מכיל אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2). מניסיוננו, היעדר סטריליות מעולם לא גרם לזיהום כלשהו.
    3. הכינו צלחות תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ, וחברו את תא אלקטרודות צלחת הפטרי לאלקטרופורטור.
      הערה: תאי אלקטרודות צלחת פטרי זמינים באופן מסחרי. עם זאת, ניתן לייצר אותם בקלות בצורה חסכונית (ראה קובץ משלים 1).
    4. באמצעות קצוות microloader, למלא מחטי microinjection עם 8 μL של כל תערובת electroporation. חותכים את קצות המחטים באמצעות מספריים עדינים לפני השימוש הראשון כדי להשיג זרימה יציבה. עם זאת, הסירו רק חלק קטן מהקצה, שכן קצה קהה ורחב עלול לפגוע קשות באורגנואידים.
      הערה: מחטי מיקרו-הזרקה זמינות מסחרית כמחטי מיקרו-הזרקה שנמשכו מראש או שניתן למשוך אותן במעבדה אם מושך מחטים זמין. עקוב אחר הוראות יצרן מושך המחטים כדי ליצור מחטי מיקרו-הזרקה עם טייפר ארוך וקוטר קצה של 10 מיקרומטר.
  2. מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה
    1. תחת מיקרוסקופ, בחר חמישה אורגנואידים מוחיים עם גבולות חלקים ומבנים דמויי חדרים נראים בבירור. העבירו אותם לצלחת תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ המכילה DMEM/F12 שחומם מראש (37°C) באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר.
      הערה: בחרו אורגנואידים מוחיים עם מבנים בולטים ונגישים דמויי חדרים (ראו איור 1B).
    2. כדי להזריק מבנה דמוי חדר, הכנס בזהירות את המחט דרך הדופן שלו, ולהחדיר אותו עם תערובת אלקטרופורציה עד למילוי גלוי. אין להפעיל לחץ מוגזם על מבנים דמויי חדרים כדי למנוע מהם להתפוצץ. המשך עם שישה עד שמונה מבנים דמויי חדרים של כל אורגנואיד מוחי באופן זה.
      הערה: אם המחט נסתמת במהלך תהליך המיקרו-הזרקה, יש לחתוך מעט את הקצה.
    3. העבר אורגנואיד מוחי אחד מוזרק מיקרו לתא אלקטרודת צלחת פטרי עם כמות קטנה של DMEM/F12. סדרו את האורגנואיד כך שהמשטחים של המבנים דמויי החדרים המוזרקים פונים לכיוון האלקטרודה המחוברת לקוטב החיובי של האלקטרופורטור.
      הערה: כיוון המבנים בדרך זו מבטיח שהתאים יהיו נגועים בצד המבנה דמוי החדר שאינו מושפע ממבנה סמוך.
    4. אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים אחד אחד באמצעות ההגדרות הבאות: 5 פולסים של 80 V, משך פעימה של 50 ms, ומרווח של 1 s. העבירו את האורגנואידים המחושלים לצלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 35 מ"מ מלאה ב-DMEM/F12 שחומם מראש (37°C).
      הערה: הגדרות האלקטרופורציה עשויות להיות תלויות באלקטרופורטור הגל הריבועי הזמין. הגדרות אלה ממוטבות עבור מערכת האלקטרופורציה המוזכרת. הגדלת המתח יכולה להוביל לעקירה של התאים.
    5. המשך באותו אופן עם חמשת האורגנואידים המוחיים הבאים באמצעות תערובת האלקטרופורציה השנייה (לדוגמה, GOI).
      הערה: חזור על שלבים 3.2.1-3.2.5 עד שתגיע למספר הרצוי של אורגנואידים מוחיים מחושמלים.
    6. אם המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה בוצעו בתנאים לא סטריליים, העבירו את האורגנואידים המחושמלים לצלחת תרבית תאים סטרילית בקוטר 35 מ"מ מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית תוך העברת כמה שפחות DMEM/F12 לצלחת תרבית התאים החדשה.
  3. תרבות נוספת וקיבוע של אורגנואידים מוחיים
    1. תרבית את האורגנואידים המחושמלים ב-DM עם ויטמין A על שייקר אורביטלי ב-55 סל"ד באטמוספירה הוחה של 5% CO2 ו-95% אוויר ב-37°C.
    2. למחרת לאחר ההתחשמלות, בדוק את האורגנואידים המוחיים לאלקטרופורציה מוצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונלי.
      הערה: בהתאם לאורך התרבית הנוספת לאחר אלקטרופורציה, אוכלוסיות תאים שונות בתוך אורגנואיד המוח מושפעות (ראה גם את סעיף התוצאות המייצגות).
    3. המשך עם יישומים במורד הזרם לאחר גידול אורגנואידים מוחיים electroporated למשך פרק זמן המתאים לשאלה הביולוגית של עניין.
      הערה: אורגנואידים מוחיים אלקטרופורציה יכולים להיות מעובדים עבור יישומים שונים במורד הזרם (למשל, קיבוע עבור צביעה immunofluorescence או הקפאה snap-frozen עבור בידוד RNA ו qRT-PCR). כאן, אנו מתארים את הקיבוע של אורגנואידים מוחיים electroporated .
    4. מעבירים את האורגנואידים המחושלים לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר, ומסירים עודפי תווך.
    5. הוסיפו כמות מספקת של 4% פרפורמאלדהיד (PFA) ב-DPBS (pH 7.5), ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      אזהרה: PFA מסווג כמסרטן בבני אדם ועלול לגרום לנזק בריאותי בלתי הפיך. אמצעי זהירות נוספים, כולל כפפות ניטריל ומשקפי מגן, מומלצים בחום.
    6. לשאוף את PFA, להוסיף 5 מ"ל של DPBS, לנער קצת, ולשאוף את DPBS. חזור על פעולה זו 2x. אחסנו את האורגנואידים ב-DPBS בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, מכיוון שניתן לאחסן אורגנואידים מוחיים קבועים ב- 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. ניתן לנתח אורגנואידים אלקטרופורטים קבועים בתקן PFA על ידי הקפאה וצביעה אימונופלואורסצנטית10,28 או על ידי צביעה וניקוי35,36 בהרכבה שלמה. לדוגמה תמונות, עיין בסעיף תוצאות מייצגות (ראה טבלה 4 לפירוט נוגדנים).

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירה יעילה של אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים, שימפנזים, רזוס מקוק ומרמוסט מצוי עם שינויי תזמון מינימליים הנדרשים בין מינים שונים (איור 1A). אורגנואידים אלה יכולים להתחשמל בטווח של 20 dps עד 50 dps, בהתאם לנגישות של מבנים דמויי חדרים ואת שפע של אוכ?...

Discussion

ההליכים המתוארים כאן מייצגים פרוטוקול אחיד ליצירת אורגנואידים מוחיים ממיני פרימטים שונים עם גישת אלקטרופורציה ממוקדת. זה מאפשר ביטוי חוץ רחמי של GOI במערכת מודל המדמה התפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגית של פרימטים (כולל בני אדם) (פתו). פרוטוקול מאוחד זה ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים משת?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מתנצלים בפני כל החוקרים שלא ניתן היה לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום. אנו מודים לאולריך בלייר מהשירותים הטכניים ב-DPZ ולהרטמוט וולף מהסדנה ב-MPI-CBG על בניית תאי אלקטרודות צלחת פטרי; סטויאן פטקוב ורודיגר בהר על אספקת iPSCs לבני אדם (iLonza2.2), מקוק רזוס (iRh33.1) ומרמוסט (cj_160419_5); סברינה היידה עבור cryosectioning ו immunofluorescence צביעה; ונרינגה ליוטקאיט וסזאר מתאו בסטידס בטנקור על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה במעבדה של W.B.H. נתמכה על ידי מענק ERA-NET NEUROON (MicroKin). העבודה במעבדה של מ.ה. נתמכה על ידי מענק התחלה של ERC (101039421).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20 µL MicroloaderEppendorf5242956003
2-MercaptoethanolMerck8.05740.0005
35 mm cell culture dishesSarstedt83.3900
60 mm cell culture dishesCytoOneCC7682-3359
Activin ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence MicroscopeZeissreplacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530Selleckchem S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)Gibco17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTX45-2052
CGP77675Sigma-AldrichSML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra Adoi: 10.7554/elife.18683 
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco14190-094pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050-061glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)Sigma-AldrichH3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)PeproTech450-03
InsulinSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)Leica10473849replacable by comparable stereomicroscopes
MatrigelCorning354277/354234basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Sigma-AldrichM7145
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldehyde Merck818715handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)PanBiotechP06-07100
Petri dish electrode chamberself-produced (see Supplemental File 1)also commertially available
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LTborosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival CompoundMerckMillipore529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)PeproTechAF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLEGibco12604-013recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well platesCostar7007
Y27632Stemcell Technologies72305

References

  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
  3. Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
  4. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  5. Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
  6. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  7. Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
  8. Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
  9. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  12. Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  13. Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
  14. Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
  15. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  16. Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
  17. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
  18. Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
  19. Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
  20. Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
  21. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  22. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  23. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  24. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
  25. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
  26. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  27. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  28. Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
  29. Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
  30. Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
  31. Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
  32. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  33. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  34. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  35. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  36. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
  37. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
  38. Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
  39. Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
  40. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  41. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved