Gezielte Mikroinjektion und Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten zur genetischen Modifikation

Zusammenfassung

Die Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten bietet einen präzisen und effizienten Ansatz, um transiente genetische Modifikationen in verschiedene Vorläufertypen und Neuronen in einem Modellsystem einzuführen, das der (patho)physiologischen Neokortexentwicklung von Primaten nahe kommt. Dies ermöglicht die Untersuchung neurologischer Entwicklungs- und Evolutionsprozesse und kann auch für die Modellierung von Krankheiten eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Die Großhirnrinde ist die äußerste Hirnstruktur und für die Verarbeitung von sensorischen und motorischen Inputs verantwortlich. Es gilt als Sitz der kognitiven Fähigkeiten höherer Ordnung bei Säugetieren, insbesondere bei Primaten. Die Untersuchung von Genfunktionen in Primatengehirnen ist aus technischen und ethischen Gründen eine Herausforderung, aber die Etablierung der Gehirnorganoid-Technologie hat die Untersuchung der Gehirnentwicklung in traditionellen Primatenmodellen (z. B. Rhesusaffen und Weißbüschelaffen) sowie in bisher experimentell unzugänglichen Primatenarten (z. B. Menschenaffen) in einem ethisch vertretbaren und technisch weniger anspruchsvollen System ermöglicht. Darüber hinaus ermöglichen menschliche Gehirnorganoide die fortgeschrittene Untersuchung neurologischer Entwicklungsstörungen und neurologischer Störungen.

Da Gehirnorganoide viele Prozesse der Gehirnentwicklung rekapitulieren, stellen sie auch ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um Unterschiede in den genetischen Determinanten zu identifizieren und funktionell zu vergleichen, die der Gehirnentwicklung verschiedener Arten in einem evolutionären Kontext zugrunde liegen. Ein großer Vorteil der Verwendung von Organoiden ist die Möglichkeit, genetische Veränderungen einzubringen, die es ermöglichen, Genfunktionen zu testen. Die Einführung solcher Modifikationen ist jedoch mühsam und teuer. Diese Arbeit beschreibt einen schnellen und kostengünstigen Ansatz zur genetischen Veränderung von Zellpopulationen innerhalb der ventrikelartigen Strukturen von Primaten-Hirnorganoiden, einer Subart von Hirnorganoiden. Diese Methode kombiniert ein modifiziertes Protokoll zur zuverlässigen Erzeugung von zerebralen Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Menschen, Schimpansen, Rhesusaffen und Weißbüschelaffen mit einem Mikroinjektions- und Elektroporationsansatz. Dies bietet ein effektives Werkzeug für die Untersuchung neurologischer Entwicklungs- und Evolutionsprozesse, das auch für die Modellierung von Krankheiten verwendet werden kann.

Einleitung

Die Untersuchung der (patho)physiologischen Entwicklung und Evolution der Großhirnrinde ist eine gewaltige Aufgabe, die durch den Mangel an geeigneten Modellsystemen erschwert wird. Bisher beschränkten sich solche Studien auf zweidimensionale Zellkulturmodelle (z. B. primäre neuronale Vorläufer- oder neuronale Zellkulturen) und evolutionär entfernte Tiermodelle (z. B. Nagetiere)^1,2. Während diese Modelle nützlich sind, um bestimmte Fragen zu beantworten, sind sie bei der Modellierung der Komplexität, der Zelltypzusammensetzung, der zellulären Architektur und der Genexpressionsmuster des sich entwickelnden mens....

Protokoll

1. Kultivierung von Primaten-iPS-Zellen

HINWEIS: Aufgrund ihrer Robustheit kann die hier vorgestellte Methode auf jede iPSC-Linie von Primaten angewendet werden. In diesem Artikel beschreiben wir die zerebrale Organoidproduktion aus humanen (iLonza2.2)29, Schimpansen (Sandra A)³⁰, Rhesusaffen (iRh33.1)²⁹ und Weißbüschelaffen (cj_160419_5⁾³¹ iPSC-Linien. Die Kulturbedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, di....

Diskussion

Die hier beschriebenen Verfahren stellen ein einheitliches Protokoll für die Erzeugung von zerebralen Organoiden aus verschiedenen Primatenarten mit einem gezielten Elektroporationsansatz dar. Dies ermöglicht die ektopische Expression eines GOI in einem Modellsystem, das die (patho)physiologische Neokortexentwicklung von Primaten (einschließlich des Menschen) nachahmt. Dieses einheitliche Protokoll für die Erzeugung von Hirnorganoiden von Primaten verwendet für alle vier vorgestellten Primatenarten die gleichen Mate.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305