灵长类动物脑类器官的靶向显微注射和电穿孔用于基因修饰

摘要

灵长类大脑类器官的电穿孔提供了一种精确有效的方法，将瞬时遗传修饰引入接近灵长类（病理）生理新皮层发育的模型系统中的不同祖细胞类型和神经元中。这允许研究神经发育和进化过程，也可以应用于疾病建模。

摘要

大脑皮层是大脑最外层的结构，负责处理感觉输入和运动输出;它被视为哺乳动物，特别是灵长类动物的高阶认知能力的所在地。由于技术和伦理原因，研究灵长类动物大脑中的基因功能具有挑战性，但大脑类器官技术的建立使得能够在传统的灵长类动物模型（例如恒河猴和普通狨猴）以及以前实验无法进入的灵长类动物物种（例如，类人猿）中研究大脑发育，在一个道德上合理且技术要求较低的系统中。此外，人脑类器官允许对神经发育和神经系统疾病进行高级研究。

由于大脑类器官概括了大脑发育的许多过程，它们也代表了一种强大的工具，可以识别进化背景下各种物种大脑发育背后的遗传决定因素的差异，并在功能上进行比较。使用类器官的一大优点是可以引入基因修饰，从而可以测试基因功能。然而，引入这种修改既费力又昂贵。本文描述了一种快速且具有成本效益的方法，用于对灵长类动物大脑类器官（大脑类器官的一种亚型）的心室样结构内的细胞群进行基因修饰。该方法将改进的方案与显微注射和电穿孔方法相结合，用于从人、黑猩猩、恒河猴和普通狨猴衍生的诱导多能干细胞 （iPSC） 中可靠生成脑类器官。这为研究神经发育和进化过程提供了有效的工具，也可以应用于疾病建模。

引言

研究大脑皮层的（病理）生理发育和进化是一项艰巨的任务，由于缺乏合适的模型系统而受到阻碍。以前，此类研究仅限于二维细胞培养模型（例如原代神经祖细胞或神经元细胞培养物）和进化上遥远的动物模型（例如啮齿动物）^1，2。虽然这些模型对于解决某些问题很有用，但它们在模拟健康和患病状态下发育中的人类新皮层的复杂性、细胞类型组成、细胞结构和基因表达模式方面受到限制。例如，这些限制导致人类疾病的小鼠模型对人类情况的可转化性差，如某些小头畸形病例所描述的那样（例如，Zhang等^人3）。最近，转基因非人灵长类动物，在进化，功能和形态上更接近人类新皮层发育的模型，已经成为焦点⁴，⁵，⁶，⁷，^8，因为它们克服了基于细胞培养和啮齿动物模型的许多限制。然而，在研究中使用非人类灵长类动物不仅非常昂贵和耗时，而且还引起了伦理问题。最近，脑类器官技术⁹，10的发展已成为一种有前途的替代方案，解决了以前模型11，

研究方案

1. 灵长类iPSCs的培养

注意：由于其稳健性，此处介绍的方法可以应用于任何灵长类iPSC系。在本文中，我们描述了人类（iLonza2.2）29，黑猩猩（Sandra A）³⁰，恒河猴（iRh33.1）²⁹和普通狨猴（cj_160419_5）³¹ iPSC系的大脑类器官生产。培养条件总结于表1中。有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅材料表。

1. 为了培养相应的iPSC，请遵循最初描述的培养条件。一般来说，为了成功生成和电穿孔脑类器官，请使用未培养超过90代的iPSC系。此外，在大脑类器官生成开始时，确保iPSCs表现出多能性特征，没有分化迹象。

2. 灵长类 iPSC 生成脑类器官

注意：脑类器官生成的方案基于原始脑类器官方案¹⁰，34的修改版本²⁸，³⁰<....

讨论

这里描述的程序代表了一个统一的方案，用于使用靶向电穿孔方法从不同的灵长类动物物种中生成大脑类器官。这允许GOI在模拟灵长类动物（包括人类）（病理）生理新皮层发育的模型系统中的异位表达。这种用于生成灵长类动物大脑类器官的统一方案对所有四种灵长类动物使用相同的材料（例如培养基）和方案步骤。这些物种之间的发育差异通过改变关键方案步骤的时间来解决（即，神经诱导?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305