灵长类动物脑类器官的靶向显微注射和电穿孔用于基因修饰

摘要

灵长类大脑类器官的电穿孔提供了一种精确有效的方法，将瞬时遗传修饰引入接近灵长类（病理）生理新皮层发育的模型系统中的不同祖细胞类型和神经元中。这允许研究神经发育和进化过程，也可以应用于疾病建模。

摘要

大脑皮层是大脑最外层的结构，负责处理感觉输入和运动输出;它被视为哺乳动物，特别是灵长类动物的高阶认知能力的所在地。由于技术和伦理原因，研究灵长类动物大脑中的基因功能具有挑战性，但大脑类器官技术的建立使得能够在传统的灵长类动物模型（例如恒河猴和普通狨猴）以及以前实验无法进入的灵长类动物物种（例如，类人猿）中研究大脑发育，在一个道德上合理且技术要求较低的系统中。此外，人脑类器官允许对神经发育和神经系统疾病进行高级研究。

由于大脑类器官概括了大脑发育的许多过程，它们也代表了一种强大的工具，可以识别进化背景下各种物种大脑发育背后的遗传决定因素的差异，并在功能上进行比较。使用类器官的一大优点是可以引入基因修饰，从而可以测试基因功能。然而，引入这种修改既费力又昂贵。本文描述了一种快速且具有成本效益的方法，用于对灵长类动物大脑类器官（大脑类器官的一种亚型）的心室样结构内的细胞群进行基因修饰。该方法将改进的方案与显微注射和电穿孔方法相结合，用于从人、黑猩猩、恒河猴和普通狨猴衍生的诱导多能干细胞 （iPSC） 中可靠生成脑类器官。这为研究神经发育和进化过程提供了有效的工具，也可以应用于疾病建模。

引言

研究大脑皮层的（病理）生理发育和进化是一项艰巨的任务，由于缺乏合适的模型系统而受到阻碍。以前，此类研究仅限于二维细胞培养模型（例如原代神经祖细胞或神经元细胞培养物）和进化上遥远的动物模型（例如啮齿动物）^1，2。虽然这些模型对于解决某些问题很有用，但它们在模拟健康和患病状态下发育中的人类新皮层的复杂性、细胞类型组成、细胞结构和基因表达模式方面受到限制。例如，这些限制导致人类疾病的小鼠模型对人类情况的可转化性差，如某些小头畸形病例所描述的那样（例如，Zhang等^人3）。最近，转基因非人灵长类动物，在进化，功能和形态上更接近人类新皮层发育的模型，已经成为焦点⁴，⁵，⁶，⁷，^8，因为它们克服了基于细胞培养和啮齿动物模型的许多限制。然而，在研究中使用非人类灵长类动物不仅非常昂贵和耗时，而且还引起了伦理问题。最近，脑类器官技术⁹，10的发展已成为一种有前途的替代方案，解决了以前模型11，¹²，¹³，¹⁴，^15，16的许多局限性。

脑类器官是三维（3D）的多细胞结构，在定义的发育时间窗口¹¹，^{12，13，14，17}内模拟一个或多个脑区域的细胞结构和细胞类型组成的主要特征。这些3D结构由诱导多能干细胞（iPSC）产生，或者，如果可用于感兴趣的物种，则由胚胎干细胞（ESC）产生。一般来说，可以根据所使用的方法区分两种类型的脑类器官:无引导和区域化（引导）脑类器官¹⁸。在生成后一种类型的类器官时，提供了小分子或因子，引导多能干细胞分化为特定大脑区域的类器官（例如，前脑类器官）¹⁸。相比之下，在无引导类器官中，分化不是由添加小分子引导的，而是完全依赖于iPSC/ESC的自发分化。由此产生的脑类器官由代表不同大脑区域的细胞类型（例如，大脑类器官）组成¹⁸。脑类器官结合了大脑发育的许多关键特征，以及从任何感兴趣的物种（iPSCs或ESCs可用）相对经济和时间高效的生成¹¹，¹²，^13，14。这使得脑类器官成为多种神经生物学研究的绝佳模型，从进化和发育问题到疾病建模和药物测试^15，16。然而，使用大脑类器官解决这些问题在很大程度上取决于不同基因修饰方法的可用性。

研究新皮层（病理）生理发育及其进化的一个关键方面是基因和基因变异的功能分析。这通常是通过这些基因的（异位）表达和/或敲低（KD）或敲除（KO）来实现的。这种遗传修饰可分为稳定和短暂的遗传修饰，以及受时间和空间限制或不受限的修饰。稳定的基因修饰是通过将遗传改变引入宿主基因组来定义的，该改变会传递给所有后续细胞世代。根据基因改造的时间点，它可以影响类器官的所有细胞，也可以仅限于某些细胞群。最常见的是，通过应用慢病毒、转座子样系统和CRISPR/Cas9技术，在iPSC/ESC水平的脑类器官中实现稳定的基因修饰（例如，Fischer等人¹⁷，Kyrousi等人¹⁹和Teriyapirom等人²⁰）。这样做的好处是，大脑类器官的所有细胞都携带基因修饰，并且不受时间或空间限制。然而，这些稳定的iPSC/ESC系的生成和表征非常耗时，通常需要几个月的时间才能分析第一个修饰的脑类器官（例如，Fischer等人¹⁷，Kyrousi等人¹⁹或Teriyapirom等人²⁰）。

相反，瞬时遗传修饰的定义是传递不整合到宿主基因组中的遗传货物（例如，基因表达质粒）。虽然这种修饰原则上可以传递给后续细胞代，但传递的遗传货物将随着每次细胞分裂而逐渐稀释。因此，这种类型的基因改造通常在时间和空间上受到限制。瞬时遗传修饰可以通过腺相关病毒或通过电穿孔在脑类器官中进行（例如，Fischer等人¹⁷，Kyrousi等人¹⁹和Teriyapirom等人²⁰审查），本文将详细描述后者。与稳定的基因改造相比，这种方法非常快速且具有成本效益。事实上，电穿孔可以在几分钟内完成，并且根据靶细胞群的不同，电穿孔类器官可以在几天内准备好进行分析（例如，由Fischer等人¹⁷ 和Kyrousi等人¹⁹审查）。然而，使用这种方法无法检测到大脑类器官的粗大形态变化，例如大小差异，因为这种类型的遗传修饰在时间和空间上受到限制。这种限制也可能是一个优势，例如，在研究类器官内的单个细胞群或在特定发育时间点对大脑类器官的影响的情况下（由例如Fischer等人¹⁷ 和Kyrousi等人¹⁹审查）。

研究大脑发育和进化过程中基因功能的经典方法是子宫电穿孔。在子宫内电穿孔是一种众所周知的有用技术，用于将基因表达构建体递送到啮齿动物21，²²，²³和雪貂^24，25的大脑中。首先，根据要靶向的区域，通过子宫壁将含有目标表达构建体的溶液显微注射到胚胎大脑的某个脑室中。在第二步中，施加电脉冲以转染直接衬在靶心室内的细胞。这种方法不仅限于异位表达或基因的过表达，因为它还可以通过显微注射短发夹（shRNA）或CRISPR / Cas9（以表达质粒或核糖核蛋白[RNPs]的形式）分别应用于KD或KO研究^26，27。然而，小鼠、大鼠和雪貂胚胎的子宫内电穿孔具有与上述这些动物模型相同的局限性。

理想情况下，人们希望直接在灵长类动物的 子宫内 进行电穿孔。虽然这在原则上在技术上是可行的，但由于伦理问题、高动物维护成本和小窝产仔数，灵长类动物不会在 子宫内 进行电穿孔。对于某些灵长类动物，例如类人猿（包括人类），这根本不可能。然而，这些灵长类动物在研究人类（病理）生理新皮层发育及其进化方面具有最大的潜力。解决这一困境的一种方法是将电穿孔技术应用于灵长类动物脑类器官²⁸。

本文提出了灵长类脑类器官亚型灵长类脑类器官电穿孔的方案。这种方法允许对类器官的心室样结构内的细胞群进行快速且具有成本效益的遗传修饰。具体来说，我们描述了从人类（智人），黑猩猩（Pan穴居人），恒河猴（Macaca mulatta）和普通狨猴（Callithrix jacchus）iPSCs中产生灵长类动物大脑类器官的统一协议。此外，我们详细描述了显微注射和电穿孔技术，并提供了进行灵长类大脑类器官电穿孔的"通过"和"不通过"标准。这种方法是研究（病理）生理新皮层发育及其在特别接近人类情况的模型中的进化的有效工具。

研究方案

1. 灵长类iPSCs的培养

注意:由于其稳健性，此处介绍的方法可以应用于任何灵长类iPSC系。在本文中，我们描述了人类（iLonza2.2）29，黑猩猩（Sandra A）³⁰，恒河猴（iRh33.1）²⁹和普通狨猴（cj_160419_5）³¹ iPSC系的大脑类器官生产。培养条件总结于表1中。有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅材料表。

1. 为了培养相应的iPSC，请遵循最初描述的培养条件。一般来说，为了成功生成和电穿孔脑类器官，请使用未培养超过90代的iPSC系。此外，在大脑类器官生成开始时，确保iPSCs表现出多能性特征，没有分化迹象。

2. 灵长类 iPSC 生成脑类器官

注意:脑类器官生成的方案基于原始脑类器官方案¹⁰，34的修改版本²⁸，^30，32，33，并进行了一些物种特异性修改（详见下文）。

1. 接种iPSCs以产生拟胚体（EB）
   1. 一旦iPSC达到80%-90%汇合度，用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤它们，并加入500 μL重组胰蛋白酶替代品或1 mL蛋白水解和胶原溶解混合物。
      注意:通常，iPSCs在60 mm细胞培养皿中培养以获得约900，000个细胞，这足以产生96个脑类器官。细胞数量可以根据所需的类器官数量进行调整。请注意，并非所有生成的脑类器官都适合电穿孔。
   2. 将培养皿在37°C孵育2分钟以分离细胞。
      注意:可能需要在37°C下再孵育2分钟，具体取决于所使用的iPSC系或酶。建议在显微镜下检查培养皿，以确保细胞已开始分离。
   3. 加入 1.5 mL 预热 （37 °C） iPSC 培养基以停止反应，并上下移液 7x-10x（不超过 10x）以使细胞从细胞培养皿中解离并获得 单细胞悬液。
   4. 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形离心管中，并在室温下以 200 × g 离心细胞 5 分钟。
   5. 吸出上清液，并将沉淀重悬于补充有 50 μM Y27632 或 50 μM 促生存化合物的 2 mL iPSC 培养基中。
   6. 使用 10 μL 细胞悬液使用纽鲍尔室对细胞进行计数。
   7. 使用补充有 50 μM Y27632 或 50 μM 促生存化合物的 iPSC 培养基，将细胞悬液调节至每 150 μL 9，000 个细胞（60，000 个细胞/mL）的浓度。
   8. 为了产生拟胚体 （EB），将 150 μL 细胞悬液接种到超低附着 96 孔板的每个孔中。移液时， 轻轻摇动 含有细胞悬液的管，以防止细胞沉淀。
   9. 在37°C（播种后0天[dps]）的5%CO₂和95%空气的腐殖气氛中培养EB。在播种后的前24小时内不要打扰EB。
      注意:由狨猴iPSC产生的EB需要在37°C的缺氧条件下（5%CO 2，5%O 2和90%N ₂）在腐殖气氛中培养。
   10. ~48小时（2dps）后，将培养基更换为 不含Y27632/促存活化合物的iPSC培养基。每孔取出 100 μL 培养基，并加入 150 μL 不含 Y27632 的预热 （37 °C） 新鲜培养基。逐行进行。
   11. 每隔一天进行进一步的介质更换;从每个孔中取出 150 μL 培养基，并在每孔中加入 150 μL 不含 Y27632/促生存化合物的预热 （37 °C） 新鲜培养基。
       注意: 在 4-5 dps 后，EB 的外围应变为半透明。
2. 神经外胚层的诱导
   注意:一般来说，高质量的EB在此阶段应具有平滑的轮廓和半透明的边框。灵长类动物和iPSC系之间的神经诱导时间点略有不同。对于此处使用的细胞系（参见第1节和材料表），狨猴EB的神经诱导通常需要从4 dps开始，恒河猴的神经诱导为5 dps，人类和黑猩猩EB的神经诱导为4-5 dps（图1A），具体取决于EB的状态（见上文）。
   1. 从96孔板第一排的每个孔中取出150μL培养基，并在同一行中每孔加入150μL预热（37°C） 神经诱导培养基 （见 表2）。
   2. 继续按照上述一行逐行更换整个96孔板的培养基。通过从每个孔中取出 150 μL NIM 并加入 150 μL 预热 （37 °C） 新鲜 NIM，每隔一天进行进一步的神经诱导培养基 （NIM） 更换。
      注意:从这一点开始，狨猴EB应在与其他灵长类EB相同的条件下培养（37°C时5%CO₂ 和95%空气的腐殖化气氛）。
3. 嵌入基底膜基质中
   注意:一旦EB在表面上形成明显的，半透明的，放射状组织的神经上皮，就需要为心室样结构的发展提供结构支持。这是通过将EB嵌入基底膜基质来实现的。由于发育速度的差异，狨猴和恒河猴EB已经准备好嵌入7 dps，而人类和黑猩猩EB通常以8-9 dps嵌入。为简单起见，基底膜基质在本协议中仅指基质胶。但是，Geltrex可以用作替代品。
   1. 在准备包埋时，对剪刀、镊子、用于 0.2 mL 管的小架子和三到六平方的封口膜在层流罩下用 70%（体积/体积）乙醇处理 15 分钟。让基底膜基质在冰上解冻数小时（~1.5 mL 基底膜基质通常足以容纳 96 EB）。
      注意: 始终 将基底膜基质放在冰上。
   2. 在封口膜上创建一个 4 x 4 的酒窝网格。将封口膜网格放在 0.2 mL 管架上，使纸封面朝上，然后用戴手套的手指轻轻按压管架的每个孔。
   3. 取出纸张，用剪刀将酒窝网格从封口膜方块中剪出，以调整其大小以适合60毫米细胞培养皿。将凹陷的封口膜放回 0.2 mL 管架上，为基底膜基质液滴的产生提供基础。
   4. 使用带有切割的 200 μL 移液器吸头的移液器，小心地将 EB 一个接一个地从培养皿孔转移到封口膜酒窝中。
   5. 将 16 个 EB 移动到网格后，取一个新的 200 μL 移液器吸头，并从酒窝中取出剩余的培养基。
   6. 将一滴（~15μL）基底膜基质移液到每个含有一个EB的酒窝上。
   7. 取 10 μL 移液器吸头， 快速 将 EB 移动到每个液滴的中心，而不会干扰液滴边界。
   8. 将带有基底膜基质滴的凹陷封口膜放入60mm细胞培养皿中，并在37°C下孵育15-30分钟以使基质聚合。
   9. 要将基质嵌入的EB从封口膜中分离，向培养皿中加入5 mL不含 维生素A的分化培养基（DM）（ 见 表2），并使用镊子将封口膜方块倒置，使EB的一侧朝向培养皿底部。
   10. 小心摇动培养皿，使含有EB的基底膜基质液滴从封口膜上分离。如果其中一些仍然附着，请使用镊子将封口膜方块的边缘，并将其快速卷向盘子的中心多次。
   11. 在37°C的5%CO₂和95%空气的腐殖气氛中以55rpm在轨道振荡器上培养脑类器官。 将它们保存在不含维生素A的DM中，每隔一天更换一次培养基。为了诱导神经元的产生，在狨猴和恒河猴大脑类器官为 13 dps 或人类和黑猩猩大脑类器官为 14-15 dps 后切换到含有维生素 A（视黄酸，RA）的 DM（图 1A）。从这一点开始，每3-4天更换一次培养基。
       注意:为了支持神经元存活，含有维生素A的DM可以从40 dps开始补充20μg/ mL人神经营养因子3（NT3），20μg/ mL脑源性神经营养因子（BDNF）和1μL/mL基底膜基质。

3. 灵长类动物脑类器官的电穿孔

注意:从技术角度来看，一旦心室样结构足够明显，可以通过显微注射靶向脑类器官，就可以进行脑类器官的电穿孔。最佳电穿孔时间窗口取决于生物学问题和感兴趣的细胞群。例如，如果顶端祖细胞（AP）是主要靶标，那么大约30 dps的大脑类器官已经是合适的了。如果基底祖细胞（BPs）或神经元是主要靶标，则应使用超过50 dps的较老的大脑类器官（例如，参见Fischer等人²⁸）。

1. 电穿孔装置的准备
   注意:电穿孔效率受电穿孔质粒的大小和浓度的强烈影响（有关详细信息，请参阅讨论部分）。
   1. 为对照和目的基因（GOI）准备足够量的电穿孔混合物，例如，每个对照和GOI准备足够量的电穿孔混合物，以在每个条件下电穿孔约30个脑类器官。
      注意:有关电穿孔混合物的组成，请参见 表3。
   2. 预热（非无菌）Dulbecco的改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM / F12）和DM与维生素A至37°C。 准备一把小刮刀和细剪刀和普通剪刀，并用70%（体积/体积）乙醇喷洒仪器。
      注意:以下步骤可以在无菌或非无菌条件下进行，因为DM含有抗生素（见 表2）。根据我们的经验，没有无菌从未造成任何污染。
   3. 准备35 mm细胞培养皿，并将培养皿电极室连接到电穿孔器。
      注意:培养皿电极室是市售的。但是，它们可以以具有成本效益的方式轻松生产（请参阅 补充文件 1）。
   4. 使用微量加载器吸头，用 8 μL 每种电穿孔混合物填充显微注射针头。第一次使用前用细剪刀剪针尖，以达到稳定的流动。但是， 仅去除尖端的一小部分，因为钝而宽的尖端会严重损坏类器官。
      注意:显微注射针可以作为预拉式显微注射针在市场上购买，也可以作为拉针器在实验室中拉动。按照拔针器制造商的说明生成具有长锥度和 10 μm 尖端直径的显微注射针。
2. 显微注射和电穿孔
   1. 在显微镜下，选择五个具有光滑边界和 清晰可见的心室样结构的大脑类器官。使用切开的 1，000 μL 移液器吸头将它们移动到含有预热 （37 °C） DMEM/F12 的 35 mm 细胞培养皿中。
      注意:选择具有明显且可触及的心室样结构的脑类器官（见 图1B）。
   2. 要注射心室样结构，请小心地将针头插入其壁，并注入电穿孔混合物，直到 明显填充。不要对心室样结构施加过大的压力，以免它们破裂。以这种方式进行每个大脑类器官的六到八个心室样结构。
      注意:如果在显微注射过程中针头堵塞，则需要稍微修剪尖端。
   3. 用少量DMEM / F12将一个显微注射的脑类器官转移到 培养皿电极室 中。以显微注射的心室样结构的表面朝向连接到电穿孔器正极的电极的方式排列类器官。
      注意:以这种方式定向结构可确保细胞转染在不受相邻结构影响的心室样结构的一侧。
   4. 使用以下设置逐个电穿孔脑类器官:5 个 80 V 脉冲、50 ms 脉冲持续时间和 1 s 间隔。将电穿孔类器官移至装有预热（37°C）DMEM / F12的新35 mm细胞培养皿中。
      注意:电穿孔设置可能取决于可用的方波电穿孔器。这些设置针对参考的电穿孔系统进行了优化。增加电压会导致电池位移。
   5. 使用第二种电穿孔混合物（例如GOI）以相同的方式处理接下来的五个大脑类器官。
      注意:重复步骤3.2.1-3.2.5，直到达到所需数量的电穿孔脑类器官。
   6. 如果在非无菌条件下进行显微注射和电穿孔，则将电穿孔类器官转移到层流罩下的 无菌 35 mm细胞培养皿中，同时尽可能少地将DMEM / F12移动到新的细胞培养皿中。
3. 脑类器官的进一步培养和固定
   1. 在37°C的5%CO₂ 和95%空气的腐殖气氛中以55rpm的轨道振荡器在DM中用维生素A培养电穿孔类器官。
   2. 电穿孔后的第二天，在常规倒置荧光显微镜下检查脑类器官是否成功电穿孔。
      注意:根据电穿孔后进一步培养的长度，大脑类器官内的不同细胞群会受到影响（另见代表性结果部分）。
   3. 在培养电穿孔的脑类器官一段时间后，继续进行下游应用，适合感兴趣的生物学问题。
      注意:电穿孔的脑类器官可以处理用于不同的下游应用（例如，用于免疫荧光染色的固定或用于RNA分离和qRT-PCR的快速冷冻）。在这里，我们描述了电穿孔脑类器官的固定。
   4. 使用切开的1，000μl移液器吸头将电穿孔类器官转移到15mL锥形离心管中，并除去多余的培养基。
   5. 在DPBS（pH 7.5）中加入足量的4%多聚甲醛（PFA），并在室温下孵育30分钟。
      注意:PFA被归类为人类致癌物，可能会造成无法弥补的健康损害。强烈建议采取额外的预防措施，包括丁腈手套和护目镜。
   6. 吸出PFA，加入5mL DPBS，摇晃一点，然后吸出DPBS。重复此操作 2 次。将类器官储存在DPBS中的4°C直至进一步使用。
      注意:该方案可以在此处暂停，因为PFA固定的脑类器官可以在4°C下储存数月。PFA固定的电穿孔类器官可以通过冷冻切片和免疫荧光染色¹⁰，²⁸或通过整体安装染色和清除^35，36进行分析。有关示例图像，请参阅代表性结果部分（抗体详细信息见表4）。

结果

此处描述的方案允许从人类、黑猩猩、恒河猴和普通狨猴 iPSC 系中有效生成大脑类器官，而物种之间所需的时间变化最小（图 1A）。这些类器官可以在20 dps至50 dps的范围内电穿孔，具体取决于心室样结构的可及性和目标细胞群的丰度。然而，在电穿孔之前，重要的是要确定脑类器官的质量是否足以进行电穿孔。

非常适合电穿孔的脑类器官应在外围表现?...

讨论

这里描述的程序代表了一个统一的方案，用于使用靶向电穿孔方法从不同的灵长类动物物种中生成大脑类器官。这允许GOI在模拟灵长类动物（包括人类）（病理）生理新皮层发育的模型系统中的异位表达。这种用于生成灵长类动物大脑类器官的统一方案对所有四种灵长类动物使用相同的材料（例如培养基）和方案步骤。这些物种之间的发育差异通过改变关键方案步骤的时间来解决（即，神经诱导?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305