霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

要約

霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションは、霊長類(病原)生理学的新皮質の発生に近いモデルシステムにおいて、異なる前駆細胞タイプおよびニューロンに一過性の遺伝子改変を導入するための正確かつ効率的なアプローチを提供します。これにより、神経発達および進化過程の研究が可能になり、疾患モデリングにも適用できます。

要約

大脳皮質は最も外側の脳構造であり、感覚入力と運動出力の処理に関与しています。それは哺乳類、特に霊長類の高次認知能力の座と見なされています。霊長類の脳における遺伝子機能の研究は、技術的および倫理的な理由から困難ですが、脳オルガノイド技術の確立により、従来の霊長類モデル(アカゲザルやコモンマーモセットなど)や、以前は実験的にアクセスできなかった霊長類種(大型類人猿など)での脳発生の研究が可能になりました。さらに、ヒトの脳オルガノイドは、神経発達および神経障害の高度な研究を可能にします。

脳オルガノイドは、脳の発達の多くの過程を再現しているため、進化の文脈でさまざまな種の脳の発達の根底にある遺伝的決定要因の違いを特定し、機能的に比較するための強力なツールでもあります。オルガノイドを使用する大きな利点は、遺伝子機能の試験を可能にする遺伝子改変を導入する可能性である。しかしながら、そのような修正の導入は面倒で費用がかかる。この論文では、脳オルガノイドのサブタイプである霊長類大脳オルガノイドの心室様構造内の細胞集団を遺伝子組み換えするための迅速で費用効果の高いアプローチについて説明します。この方法は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、および一般的なマーモセット由来の人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを確実に生成するための修正プロトコルと、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションアプローチを組み合わせたものです。これは、疾患モデリングにも適用できる神経発達および進化過程の研究のための効果的なツールを提供します。

概要

大脳皮質の(病的)生理学的発達と進化を調査することは、適切なモデルシステムの欠如によって妨げられている手ごわい仕事です。以前は、このような研究は、二次元細胞培養モデル(初代神経前駆細胞や神経細胞培養など)と進化的に遠い動物モデル(げっ歯類など)に限定されていました^1,2。これらのモデルは特定の問題に対処するのに役立ちますが、健康な状態と病気の状態で発達中のヒト新皮質の複雑さ、細胞タイプの組成、細胞構造、および遺伝子発現パターンのモデリングには制限があります。これらの制限は、例えば、小頭症の特定の症例について記載されているように、ヒト疾患のマウスモデルのヒト状況への翻訳可能性の低さにつながる(例えば、Zhangら³)。最近、ヒト新皮質発生の進化的、機能的、形態学的に近いモデルであるトランスジェニック非ヒト霊長類が、細胞培養およびげっ歯類ベースのモデルの多くの制限を克服するにつれて、焦点が当てられています^4,5,6,7,8。しかし、研究におけるヒト以....

プロトコル

1. 霊長類iPS細胞の培養

注:その堅牢性により、ここで紹介する方法は、あらゆる霊長類iPS細胞株に適用できます。本稿では、ヒト(iLonza2.2)²⁹、チンパンジー(Sandra A)³⁰、アカゲザル(iRh33.1)²⁹、およびコモンマーモセット(cj_160419_5)³¹ iPS細胞株からの脳オルガノイド産生について述べる。培養条件を 表1にまとめた。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 各iPS細胞の培養については、当初記載した培養条件に従う。一般に、脳オルガノイドの作製とエレクトロポレーションを成功させるには、90継代以上培養されていないiPS細胞株を使用します。さらに、脳オルガノイド生成の開始時に、iPS細胞が分化の兆候のない多能性の特徴を示すことを確認します。

2. 霊長類iPS細胞からの大脳オルガノイドの作製

注:脳オル....

ディスカッション

ここで説明する手順は、ターゲットを絞ったエレクトロポレーションアプローチを用いて、異なる霊長類種から脳オルガノイドを生成するための統一されたプロトコルを表しています。これにより、霊長類(ヒトを含む)(病的)生理学的新皮質発達をエミュレートするモデルシステムにおけるGOIの異所性発現が可能になります。霊長類大脳オルガノイドの生成のためのこの統一されたプロトコル.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305