تقييم حجم قطرات الدهون والاندماج في الخلايا الكبدية البقرية

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الزيت الأحمر O لصبغ قطرات الدهون (LDs) ، وحساب حجم وعدد LDs في نموذج خلايا الكبد الدهنية التي يسببها الأحماض الدهنية ، واستخدام BODIPY 493/503 لمراقبة عملية اندماج LDs الصغيرة في LDs الكبيرة عن طريق تصوير الخلايا الحية.

Abstract

قطرات الدهون (LDs) هي عضيات تلعب دورا مهما في استقلاب الدهون وتخزين الدهون المحايد في الخلايا. ترتبط بمجموعة متنوعة من الأمراض الأيضية ، مثل السمنة وأمراض الكبد الدهنية والسكري. في الخلايا الكبدية ، تعد أحجام وأعداد LDs علامات على مرض الكبد الدهني. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون تفاعل الإجهاد التأكسدي ، والالتهام الذاتي للخلايا ، وموت الخلايا المبرمج مصحوبا بتغيرات في أحجام وأعداد LDs. نتيجة لذلك ، فإن أبعاد وكمية LDs هي أساس البحث الحالي فيما يتعلق بآلية التكوين الحيوي LD. هنا ، في الخلايا الكبدية البقرية التي تسببها الأحماض الدهنية ، نصف كيفية استخدام الزيت الأحمر O لتلطيخ LDs والتحقيق في أحجام وأعداد LDs. يتم تحليل توزيع حجم LDs إحصائيا. تتم ملاحظة عملية اندماج LDs الصغيرة في LDs الكبيرة أيضا بواسطة نظام تصوير الخلايا الحية. يوفر العمل الحالي طريقة لمراقبة اتجاه تغيير حجم LDs بشكل مباشر في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة.

Introduction

تراكم قطرات الدهون (LD) في خلايا الكبد هو السمة النموذجية لمرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والذي يمكن أن يتطور إلى تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية. وقد وجد أن أول مظهر من مظاهر مرض الكبد الدهني هو تنكس دهني ، يتميز بتراكم LD في السيتوبلازم في خلايا الكبد¹. يرتبط تنكس دهني الكبد دائما بزيادة عدد و / أو توسيع حجم LDs². يعتقد أن LDs تتولد من الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، التي تتكون من الدهون الثلاثية (TG) كنواة ، وتحيط بها البروتينات والدهون الفوسفاتية³. باعتبارها العضية تحت الخلوية المسؤولة عن تخزين TG ، تظهر LDs ميزات مختلفة فيما يتعلق بحجمها وعددها وتكوين الدهون والبروتينات والتفاعل مع العض....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات وتنفيذها وفقا للمعايير الأخلاقية للجنة رعاية الحيوان بجامعة خنان الزراعية (مقاطعة خنان ، الصين).

1. زراعة خلايا الكبد البقري

1. قم بإذابة خلايا الكبد الأولية¹⁷ وأجهزة الطرد المركزي 400 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: تم استزراع خلايا الكبد الأولية والحفاظ عليها بعد تقرير نشر سابقا¹⁷.
2. تخلص من محلول التخزين المجمد باستخدام ماصة وعلقه ب 1 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). بعد ذلك ، استخدم غرفة عد الخلايا لحساب عدد الخلايا لكل مليلتر ، ثم احسب تركيز ....

النتائج

يوضح الشكل 1 تلطيخ LDs الخلية. تعكس النقاط الحمراء LDs الخلوية ، وتعكس النقاط الزرقاء النوى. يمكن ملاحظة أن حجم وعدد LDs في كل صورة مختلفان تحت معاملة LA.

مع الزيادة في جرعة LA ، أظهر متوسط قطر وعدد LDs اتجاها متزايدا بشكل ملحوظ ، اعتمادا على تركيز LA (الشكل 2<.......

Discussion

اعتمادا على الحالات المرضية ، تخضع LDs الكبدية لتغييرات هائلة في حجمها وعددها. LDs موجودة على نطاق واسع في خلايا الكبد وتلعب دورا رئيسيا في صحة الكبد والأمراض¹⁸. كمية وحجم LDs هي أساس البحث الحالي حول التكوين الحيوي ل LDs¹⁹. يعكس حجم وعدد LDs للخلايا والأنسجة قدرتها على تخز.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent