Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD'ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD'lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503'ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.

Özet

Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid metabolizmasında ve hücrelerde nötr lipid depolanmasında önemli rol oynayan organellerdir. Obezite, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabet gibi çeşitli metabolik hastalıklarla ilişkilidirler. Hepatik hücrelerde, LD'lerin boyutları ve sayıları yağlı karaciğer hastalığının belirtileridir. Ayrıca, oksidatif stres reaksiyonu, hücre otofajisi ve apoptoza genellikle LD'lerin boyutlarında ve sayılarında değişiklikler eşlik eder. Sonuç olarak, LD'lerin boyutları ve miktarları, LD biyogenezinin mekanizması ile ilgili mevcut araştırmaların temelini oluşturmaktadır. Burada, yağ asidine bağlı sığır karaciğer hücrelerinde, LD'leri boyamak ve LD'lerin boyutlarını ve sayılarını araştırmak için yağ kırmızısı O'nun nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. LD'lerin boyut dağılımı istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma süreci de canlı hücre görüntüleme sistemi tarafından gözlemlenir. Mevcut çalışma, farklı fizyolojik koşullar altında LD'lerin boyut değişim eğilimini doğrudan gözlemlemenin bir yolunu sunmaktadır.

Giriş

Hepatositlerde lipid damlacığı (LD) birikimi, karaciğer fibrozisi ve hepatosellüler karsinoma ilerleyebilen alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tipik özelliğidir. Yağlı karaciğer hastalığının en erken belirtisinin, hepatosit^1'in sitoplazmasında LD birikimi ile karakterize steatoz olduğu bulunmuştur. Karaciğer steatozu her zaman LDs^2'nin artmış sayısı ve / veya genişlemiş boyutu ile ilişkilidir. LD'lerin, çekirdek olarak trigliseritten (TG) oluşan endoplazmik retikulumdan (ER) üretildiği ve proteinler ve fosfolipitlerle çevrili olduğu düşünülmektedir³. TG depolamasından sorumlu hücre altı organel olarak, LD'ler boyutları, sayıları, lipit kompozisyonları, proteinleri ve diğer organellerle etkileşimleri ile ilgili farklı özellikler sergilerler ve bunların hepsi hücre enerjisi homeostazını etkiler⁴. TG seviyesi LD'lerin boyutu ile pozitif ilişkilidir ve daha yüksek bir hücre içi TG içeriği daha büyük LD'ler^{oluşturabilir 5}. LD'ler, TG'nin lokal sentezi, ER'de lipit katılımı ve çoklu LD'lerin füzyonu yoluyla boyut olarak artar⁶. Büyük LD'ler içeren hücreler (adipositler, hepatositler, vb.), LD füzyonu ile lipit depolanmasını etkili bir şekilde arttırmak için özel bir mekanizmaya sahiptir. LD'lerin dinamik değişiklikleri, hücrenin farklı enerji metabolizması durumlarını yansıtır. Sağlıklı ve anormal hücrelerdeki çeşitli hepatik LD'lerin gözlemlenmesine ve analizine izin veren metodolojiler geliştirmek çok önemlidir.

LD'ler için ana floresan olmayan boyalar Sudan Siyah B ve yağ kırmızısı O. Sudan Siyah B nötr lipitleri, fosfolipitleri ve steroidleri boyar⁷. Yağ kırmızısı O esas olarak iskelet kası, kardiyomiyositler, karaciğer dokusu, yağ hücreleri, vb.^LD'leri boyamak için kullanılır 8 ve farelerde ve insanlarda karaciğer steatozunun kantitatif tespiti için standart bir araç olarak kabul edilir⁹. LD'lerin dinamik değişimi esas olarak floresan boyama ile gerçekleştirilir. Nil kırmızısı ve BODIPY yaygın olarak kullanılan floresan lipit boyalarıdır^10,11. Nil kırmızısı ile karşılaştırıldığında, BODIPY daha güçlü doku geçirgenliğine sahiptir ve LDs¹² ile daha iyi bağlanır. BODIPY etiketli LD'ler, canlı hücreleri boyamak ve diğer organellerle kolokalizasyon için kullanılabilir¹³.

Ruminant hayvanlarda yağlı karaciğer hastalığı insidansı monogastrik hayvanlara göre anlamlı derecede yüksektir¹⁴. Geçiş döneminde, süt negatif enerji dengesi durumu yaşarlar³. Büyük miktarlarda esterleştirilmemiş yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, vb.) sığır hepatositlerinde TG'lere sentezlenir, bu da karaciğer fonksiyonel anormalliğine yol açar ve süt ürünlerinin kalitesini ve üretim verimliliğini büyük ölçüde azaltır¹⁵. Bu çalışma, LD'lerin boyut ve sayılarını analiz etmek ve LD füzyon dinamiklerini izlemek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Hepatositler^16'ya farklı konsantrasyonlarda linoleik asit (LA) ekleyerek bir LD oluşum modeli oluşturduk ve LD'leri yağ kırmızısı O ile boyayarak işlem sırasında LD'lerin boyutundaki ve sayısındaki değişiklikleri gözlemledik. Ek olarak, LD'lerin hızlı füzyon süreci BODIPY 493/503 ile boyanarak da gözlenmiştir.

Protokol

Tüm prosedürler Henan Tarım Üniversitesi (Henan Eyaleti, Çin) Hayvan Bakım Komitesi'nin etik standartlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.

1. Sığır hepatosit hücre kültürü

1. Birincil hepatosit hücreleri^17'yi çözün ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 400 x g santrifüj yapın.
   NOT: Primer hepatosit hücreleri kültürlendi ve daha önce yayınlanmış bir rapor^17'yi takiben muhafaza edildi.
2. Dondurulmuş depolama solüsyonunu bir pipetle atın ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içeren 1 mL ortam ile askıya alın. Ardından, mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre konsantrasyonunu 1 x 10⁷ hücre / mL'ye ayarlayın.
   1. Hücre süspansiyonunu, yukarıdaki ortamın 3 mL'sini içeren 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına ekleyin. Hücreleri kültürleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
3. Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın, ardından hücreleri sindirmek için 750 μL% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreleri 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından aynı miktarda% 10 FBS ile nötralize edin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapmak için hücre süspansiyonunu toplayın.

2. Yağ kırmızısı O boyama

1. Cam kapaklar içeren 24 delikli hücre kültür plakasının her bir kuyucuğuna %10 FBS ve DMEM içeren 800 μL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini alın (adım 1.3'te elde edilen) ve karıştırmak için 950 μL PBS'ye ekleyin. Mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın. Son olarak, hücre konsantrasyonunu her bir kuyucukta 4 x 10⁴ / mL'ye ayarlayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
2. 24 saat sonra, kültür ortamını atın ve PBS ile yıkayın. 1 mg/mL sığır serum albümini (BSA) içeren 800 μL DMEM indüksiyon ortamı ile askıya alın.
3. Toplam 100 μL LA'yı 900 μL susuz etanol içinde çözün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart bir çözelti (100 mmol / L) hazırlayın. 24 delikli plakaya 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L ve 200 μmol/L LA gradyanı ekleyin. Her tedaviyi dört kez tekrarlayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
4. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 20 dakika boyunca 400 μL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksatif çözeltiyi atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
5. Hücreleri 5 dakika boyunca% 60 izopropil alkol ile inkübe edin, sonra atın. Taze hazırlanmış yağ kırmızısı O çalışma solüsyonunu ( bakınız Malzeme Tablosu) (3:2 yağ kırmızısı O:su oranı) 20-30 dakika boyunca ekleyin ve boyama solüsyonunu atın. Fazla boya çözeltisi kalmayana kadar hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın.
6. 300 μL hematoksilin boyama çözeltisi ekleyin (hematoksilin: 1:10 su oranı) ve çekirdeği 1-2 dakika boyunca yeniden boyayın. Boya çözeltisini atın ve hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın. Cam kapak kapaklarını 24 delikli plakadan çıkarın ve slaytın üzerine 10 μL tablet sızdırmazlık maddesi (bkz.
7. Sızdırmazlıktan sonra, optik mikroskobun yağ merceği altındaki hücrelerin LD'lerini gözlemleyin ve görüntüleyin (bkz. LD'lerin çapını cellSens yazılımı ile ölçün ve LD'lerin sayısını ve boyutunu analiz edin.

3. LD'lerin boyutunun ve sayısının ölçülmesi

1. Görüntü yakalama: Bilgisayarı ve mikroskop anahtarını art arda açın, slaytı yükleme platformuna yerleştirin, görüntü analiz yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntüyü görüntülemek için bilgisayarı bağlayın.
   1. Görüntüleri düşük güçte bulun ve görüntüleme slaytına uygun miktarda sedir yağı damlatın. Gözlem faktörünü 100x'e ayarlayın, otomatik pozlamayı ayarlayın ve uygun görüş alanını ayarlayarak görüntüleri yakalayın. Görüntüleme için her grup için üç boyalı hücre slaytı seçin.
2. Çap ölçümü: Çapları ölçmek için her görüntü için rastgele 60 LD seçin. Her görüntünün ölçümünden sonra, görüntüleri kaydedin ve LD'lerin ortalama boyutunun ve dağılım oranının daha sonraki analizi için ölçüm sonuçlarını bir tabloya çıkarın.
3. Miktar ölçümü: Her boyanmış ve fotoğraflanmış slayt için üç görüntü seçin ve her resimde miktar ölçümü için rastgele üç hücre seçin. Hücrenin etrafındaki LD sayısını sayıp analiz edin ve hücredeki ortalama LD sayısını hesaplayın.

4. LD füzyonunun dinamik gözlemi

1. Adım 1.1-1.3'te belirtilen hücre kültürü adımlarını izleyin. Hücreler% 80'e kadar büyüdüğünde, ortamı atın ve PBS ile durulayın, ardından 3 dakika boyunca 750 μL tripsin ile sindirin. Daha sonra, 750 μL ortam ekleyin, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
2. Hücreleri 1 mL kültür ortamında askıya alın, sayın ve hücre konsantrasyonunu 35 mm'lik bir tabakta 5 x 10⁵ hücre / mL'ye ayarlayın. 37 °C'de kültür ve 24 saat boyunca %5 CO₂ .
3. Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı 24 saat boyunca DMEM + 150 μmol / L LA olarak değiştirin ve LD'leri biriktirmek için kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde devam edin.
4. 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın. Yapışkan hücreleri PBS ile yıkayın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 10 μg / mL BODIPY 493/503 nötr floresan probu (bkz. Kuluçkadan sonra, kültür kabındaki hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve DMEM + 150 μmol / L LA ekleyin.
   NOT: 10 μg/mL BODIPY boyama sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmaktan kaçının; 1 mg/mL BODIPY PBS (1:100) ile seyreltildi.
5. LD'lerin dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kültür kabını canlı hücre istasyonunun mikroskobunun oluğuna yerleştirin (bkz.
   1. Güç, iletim ışık kaynağı, mikroskop güç kaynağı, cıva lambası floresan ışık kaynağı, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera güç kaynağı, bilgisayar ana bilgisayar güç kaynağı, CO 2 valfi ve CO₂ inkübatörünü açın.
6. Yükleme platformundaki oluğa damıtılmış su ekleyerek havalandırma deliğinden geçmediğinizden emin olun.
7. Bilgisayarı açın ve "NIS-Elements" ı çalıştırın. İlk olarak, 4x objektif lenste uygun görüş alanını bulun, ardından art arda 40x objektif lense ayarlayın. Örneği mikroskopta gözlemlemek için E100'ü ve örneği bilgisayarda önizlemek ve fotoğraflamak için L100'ü seçin.
   NOT: E100 ve L100, canlı hücre iş istasyonundaki mikroskop ayar düğmeleridir (bkz. Malzeme Tablosu), sırasıyla göz merceğini ve bilgisayar ekranını temsil eder.
8. Floresan kanalı (örneğin, Ph-40x, Floresein izotiyosiyanat [FITC], deklanşör) ve deney için beklenen çekim süresi gibi parametreleri tasarlayın. Her iki görüntü arasındaki 5 dakikalık çekim aralığı ve toplam 6 saatlik çekim süresi dahil olmak üzere çekim süresini zamanında ayarlayın.
   NOT: Uzun süreli çekimlerde mükemmel netleme sistemi (PFS) netleme sabitleme işlevinin kullanılması gerekir. Bunun için önce görüş alanını ve netleme uzunluğunu ayarlayın, ardından bilgisayar ekranında PFS'ye tıklayın ve son olarak ince netleme spiralini ayarlayın.
9. Farklı kanal modları, tek kanal veya tümü seçin, farklı bir görüş alanı seçin, önizleme'yi tıklayın, görüş alanını ayarlayın, bu parametreleri ayarlayın ve çekime başlamak için koşmaya başla'yı tıklayın. Önce 5 dakika boyunca bir test çekimi yapın; Operasyon normal olduktan sonra uzun zaman alabilir.
10. Çekim gerçekleştirildikten sonra, verileri 'avi' formatında bir videoya dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet > Kaydet türü > avi formatını seçin. Veri programını kaydetmek ve fotoğrafları dışa aktarmak için '.nd2' görüntü biçimini kullanın.
11. Makineyi kapatmak için, ters sırada kapatın.

5. İstatistik ve sonuç analizi

1. Tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin. Sonuçları ortalama ± standart hata olarak raporlayın.

Sonuçlar

LD hücrelerinin boyanması Şekil 1'de gösterilmiştir. Kırmızı noktalar hücre LD'lerini yansıtır ve mavi noktalar çekirdekleri yansıtır. LA tedavisinde her resimdeki LD'lerin boyut ve sayısının farklı olduğu görülebilir.

LA dozajındaki artışla birlikte, LD'lerin ortalama çapı ve sayısı, LA konsantrasyonuna bağlı olarak önemli ölçüde artan bir eğilim göstermiştir (Şekil 2). Şeki...

Tartışmalar

Patolojik durumlara bağlı olarak, hepatik LD'ler boyutlarında ve sayılarında muazzam değişikliklere uğrarlar. LD'ler hepatosit hücrelerinde yaygın olarak bulunur ve karaciğer sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar¹⁸. LD'lerin miktarı ve büyüklüğü, LD'lerin biyogenezi üzerine yapılan güncel araştırmaların temelidir¹⁹. Hücreler ve dokular için LD'lerin büyüklüğü ve sayısı, enerji depolama ve serbest bırakma yeteneklerini yansıt?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent