Evaluierung der Lipidtröpfchengröße und -fusion in bovinen Leberzellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie man ölrotes O verwendet, um Lipidtröpfchen (LDs) zu färben, die Größe und Anzahl von LDs in einem Fettsäure-induzierten Fetthepatozytenmodell zu berechnen und BODIPY 493/503 zu verwenden, um den Prozess der Verschmelzung kleiner LDs zu großen LDs durch Lebendzellbildgebung zu beobachten.

Zusammenfassung

Lipidtröpfchen (LDs) sind Organellen, die eine wichtige Rolle im Fettstoffwechsel und bei der neutralen Lipidspeicherung in Zellen spielen. Sie werden mit einer Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen wie Fettleibigkeit, Fettleber und Diabetes in Verbindung gebracht. In Leberzellen sind Größe und Anzahl der LDs Anzeichen für eine Fettlebererkrankung. Darüber hinaus gehen die oxidative Stressreaktion, die Zellautophagie und die Apoptose oft mit Veränderungen in der Größe und Anzahl der LDs einher. Daher sind die Abmessungen und die Menge der LDs die Grundlage der aktuellen Forschung zum Mechanismus der LD-Biogenese. In dieser Arbeit beschreiben wir in fettsäureinduzierten bovinen Leberzellen, wie man ölrotes O zur Färbung von LDs und zur Untersuchung der Größe und Anzahl von LDs verwendet. Die Größenverteilung der LDs wird statistisch ausgewertet. Der Prozess der Verschmelzung kleiner LDs zu großen LDs wird auch von einem Lebendzell-Bildgebungssystem beobachtet. Die vorliegende Arbeit bietet eine Möglichkeit, den Größenänderungstrend von LDs unter verschiedenen physiologischen Bedingungen direkt zu beobachten.

Einleitung

Die Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in Hepatozyten ist das typische Merkmal der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die zu Leberfibrose und hepatozellulärem Karzinom fortschreiten kann. Es wurde festgestellt, dass die früheste Manifestation einer Fettlebererkrankung die Steatose ist, die durch eine LD-Akkumulation im Zytoplasma der Hepatozyten^{gekennzeichnet ist 1}. Eine Lebersteatose ist ausnahmslos mit einer erhöhten Anzahl und/oder einer erweiterten Größe von LDs² verbunden. Es wird angenommen, dass LDs aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) gebildet werden, das aus Triglyceriden (TG) als Kern besteht, und von Proteinen und Phospholipiden umgeben sind³. Als subzelluläre Organelle, die für die TG-Speicherung verantwortlich ist, weisen LDs unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf Größe, Anzahl, Lipidzusammensetzung, Proteine und Interaktion mit anderen Organellen auf, die alle die Zellenergiehomöostase beeinflussen⁴. Der TG-Spiegel korreliert positiv mit der Größe der LDs, und ein höherer intrazellulärer TG-Gehalt könnte größere LDs bilden⁵. LDs nehmen durch die lokale Synthese von TG, den Einbau von Lipiden in das ER und die Fusion mehrerer LDs an Größe^{zu 6}. Zellen (Adipozyten, Hepatozyten usw.), die große LDs enthalten, verfügen über einen speziellen Mechanismus, um die Lipidspeicherung durch LD-Fusion effizient zu erhöhen. Die dynamischen Veränderungen der LDs spiegeln die unterschiedlichen Zustände des Energiestoffwechsels der Zelle wider. Es ist von entscheidender Bedeutung, Methoden zu entwickeln, die die Beobachtung und Analyse der verschiedenen Leber-LDs in gesunden und abnormen Zellen ermöglichen.

Die wichtigsten nicht-fluoreszierenden Farbstoffe für LDs sind Sudan Black B und Oil Red O. Sudan Black B färbt neutrale Lipide, Phospholipide und Steroide⁷. Ölrot O wird hauptsächlich zur Färbung von LDs von Skelettmuskeln, Kardiomyozyten, Lebergewebe, Fettzellen usw.^{verwendet 8}. und gilt als Standardwerkzeug für den quantitativen Nachweis von Lebersteatose bei Mäusen und Menschen⁹. Die dynamische Veränderung von LDs erfolgt hauptsächlich durch Fluoreszenzfärbung. Nilrot und BODIPY sind beides häufig verwendete fluoreszierende Lipidfarbstoffe^10,11. Im Vergleich zu Nilrot hat BODIPY eine stärkere Gewebedurchlässigkeit und bindet besser an LDs¹². BODIPY-markierte LDs können für die Färbung lebender Zellen und die Kolokalisation mit anderen Organellen verwendet werden¹³.

Die Inzidenz einer Fettlebererkrankung ist bei Wiederkäuern signifikant höher als bei monogastrischen Tieren¹⁴. Während der Übergangszeit erleben Milchkühe einen Zustand negativer Energiebilanz³. In Rinderhepatozyten werden große Mengen an nicht veresterten Fettsäuren (Palmitinsäure, Ölsäure, Linolsäure usw.) zu TGs synthetisiert, was zu Funktionsstörungen der Leber führt und die Qualität der Milchprodukte und die Produktionseffizienz erheblich verringert¹⁵. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Protokoll zur Analyse der Größe und Anzahl der LDs sowie zur Überwachung der LD-Fusionsdynamik bereitzustellen. Wir konstruierten ein Modell der LD-Bildung durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von Linolsäure (LA) in Hepatozyten¹⁶ und beobachteten die Veränderungen in der Größe und der Anzahl der LDs während des Prozesses, indem wir LDs mit ölrotem O färbten. Darüber hinaus wurde der Prozess der schnellen Fusion von LDs auch durch Färbung mit BODIPY 493/503 beobachtet.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards des Tierpflegekomitees der Henan Agricultural University (Provinz Henan, China) genehmigt und durchgeführt.

1. Rinder-Hepatozyten-Zellkultur

1. Tauen Sie die primären Hepatozytenzellen¹⁷ auf und zentrifugieren Sie 400 x g für 4 min bei Raumtemperatur.
   ANMERKUNG: Die primären Hepatozytenzellen wurden nach einem zuvor veröffentlichten Bericht kultiviert und gepflegt¹⁷.
2. Verwerfen Sie die gefrorene Aufbewahrungslösung mit einer Pipette und suspendieren Sie sie mit 1 ml Medium, das 10 % fötales Kälberserum (FBS) und Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) enthält. Verwenden Sie als Nächstes eine Zellzählkammer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu berechnen, und berechnen Sie dann die Konzentration der oben genannten Zellsuspension und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 10⁷ Zellen/ml ein.
   1. Geben Sie die Zellsuspension in eine 60-mm-Zellkulturschale, die 3 ml des oben genannten Mediums enthält. Kultur der Zellen und Inkubation bei 37 °C und 5% CO₂ für 24 h.
3. Wenn die Zellen auf 80 % angewachsen sind, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie es mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab, dann fügen Sie 750 μl 0,25 % Trypsin hinzu, um die Zellen zu verdauen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 3 min und neutralisieren Sie sie dann mit der gleichen Menge von 10% FBS. Sammeln Sie die Zellsuspension, um sie bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur zu zentrifugieren.

2. Ölrote O-Färbung

1. Geben Sie 800 μl Nährmedium mit 10 % FBS und DMEM in jede Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte, die Glasdeckgläser enthält. Man nehme 50 μl der Zellsuspension (erhalten in Schritt 1.3) und füge sie zu 950 μl PBS hinzu, um sie zu mischen. Verwenden Sie eine Zellzählkammer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu berechnen, und berechnen Sie dann die Konzentration der oben genannten Zellsuspension. Zum Schluss wird die Zellkonzentration in jeder Vertiefung auf 4 x 10⁴/ml eingestellt und bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 h inkubiert.
2. Nach 24 Stunden das Nährmedium verwerfen und mit PBS waschen. Mit 800 μl DMEM-Induktionsmedium mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) suspendieren.
3. Insgesamt 100 μl LA (siehe Materialtabelle) werden in 900 μl wasserfreiem Ethanol gelöst und eine Standardlösung (100 mmol/L) hergestellt. Fügen Sie einen Gradienten von 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L und 200 μmol/L LA in die 24-Well-Platte ein. Wiederholen Sie jede Behandlung viermal. Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 h.
4. Entfernen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Mit 400 μl 4%igem Paraformaldehyd für 20 min fixieren. Entsorgen Sie die Fixierlösung und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
5. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 60%igem Isopropylalkohol und entsorgen Sie ihn dann. Frisch zubereitete ölrote O-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) (3:2-Verhältnis ölrotes O:Wasser) für 20-30 min zugeben und die Färbelösung verwerfen. Waschen Sie die Zellen zwei- bis fünfmal mit PBS, bis keine überschüssige Farbstofflösung mehr vorhanden ist.
6. Fügen Sie 300 μl Hämatoxylin-Färbelösung hinzu (Hämatoxylin:Wasser-Verhältnis von 1:10) und färben Sie den Zellkern für 1-2 Minuten erneut. Verwerfen Sie die Farbstofflösung und waschen Sie die Zellen zwei- bis fünfmal mit PBS. Nehmen Sie die Glasdeckgläser von der 24-Well-Platte heraus und legen Sie sie auf mikroskopisch kleine Objektträger (die Seite mit den Zellen nach unten), nachdem Sie 10 μl Tablettendichtmittel (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger getropft haben.
7. Nach dem Versiegeln werden die LDs der Zellen unter der Öllinse des Lichtmikroskops beobachtet und abgebildet (siehe Materialtabelle). Messen Sie den Durchmesser der LDs mit der cellSens-Software und analysieren Sie die Anzahl und Größe der LDs.

3. Messung der Größe und Anzahl der LDs

1. Bilder aufnehmen: Schalten Sie den Computer und den Mikroskopschalter nacheinander ein, legen Sie den Objektträger auf die Ladeplattform, öffnen Sie die Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und schließen Sie den Computer an, um das Bild anzuzeigen.
   1. Suchen Sie die Bilder bei geringer Leistung und tropfen Sie eine angemessene Menge Zedernöl auf den Objektträger. Stellen Sie den Beobachtungsfaktor auf 100x ein, stellen Sie die automatische Belichtung ein und nehmen Sie die Bilder auf, indem Sie das entsprechende Sichtfeld anpassen. Wählen Sie für jede Gruppe drei Objektträger mit gefärbten Zellen für die Bildgebung aus.
2. Durchmessermessung: Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 60 LDs für jedes Bild aus, um die Durchmesser zu messen. Speichern Sie nach der Messung jedes Bildes die Bilder und geben Sie die Messergebnisse in einer Tabelle aus, um anschließend die durchschnittliche Größe und das Verteilungsverhältnis der LDs zu analysieren.
3. Mengenmessung: Wählen Sie drei Bilder für jeden gefärbten und fotografierten Objektträger aus und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Zellen für die Mengenmessung in jedem Bild aus. Zählen und analysieren Sie die Anzahl der LDs um die Zelle herum, und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der LDs in der Zelle.

4. Dynamische Beobachtung der LD-Fusion

1. Befolgen Sie die Schritte zur Zellkultur, wie in den Schritten 1.1-1.3 beschrieben. Wenn die Zellen zu 80 % gewachsen sind, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie es mit PBS aus, dann verdauen Sie sie 3 Minuten lang mit 750 μl Trypsin. Als nächstes fügen Sie 750 μl des Mediums hinzu, zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
2. Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml Nährmedium, zählen Sie und stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 10⁵ Zellen/ml in einer 35-mm-Schale ein. Kultur bei 37 °C und 5% CO₂ für 24 h.
3. Wenn die Zellen auf 80 % gewachsen sind, wechseln Sie das Medium für 24 h auf DMEM + 150 μmol/L LA und setzen Sie die Kultur in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ fort, um die LDs zu akkumulieren.
4. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Nährmedium. Waschen Sie die adhärenten Zellen mit PBS und inkubieren Sie sie mit der neutralen Fluoreszenzsonde BODIPY 493/503 mit 10 μg/ml (siehe Materialtabelle) im Dunkeln für 30 min. Nach der Inkubation werden die Zellen in der Kulturschale dreimal mit PBS gewaschen und DMEM + 150 μmol/L LA zugegeben.
   Anmerkungen: Vermeiden Sie Lichteinwirkung während und nach der 10 μg/ml BODIPY-Färbung; 1 mg/ml BODIPY wurde mit PBS (1:100) verdünnt.
5. Stellen Sie die Kulturschale in die Nut des Mikroskops der Station für lebende Zellen (siehe Materialtabelle), um die dynamischen Veränderungen der LDs zu beobachten. Schalten Sie die Workstation der lebenden Zelle entsprechend der Startreihenfolge ein und vermeiden Sie Licht.
   1. Schalten Sie die Stromversorgung, die Transmissionslichtquelle, die Mikroskopstromquelle, die Quecksilberlampen-Leuchtstofflampe, die Stromquelle der CCD-Kamera (Charge-Coupled Device), die Computer-Host-Stromquelle, das CO 2 -Ventil und den CO_{2 -}Inkubator ein.
6. Geben Sie destilliertes Wasser in die Nut auf der Ladefläche und achten Sie darauf, dass es nicht über die Lüftungsöffnung geht.
7. Schalten Sie den Computer ein und führen Sie "NIS-Elements" aus. Suchen Sie zuerst das entsprechende Sichtfeld auf der 4-fach-Objektivlinse und stellen Sie es dann nacheinander auf die 40-fach-Objektivlinse ein. Wählen Sie E100 für die Beobachtung der Probe im Mikroskop und L100 für die Vorschau und das Fotografieren der Probe am Computer.
   HINWEIS: E100 und L100 sind Mikroskop-Einstelltasten an der Workstation der lebenden Zelle (siehe Materialtabelle), die das Okular bzw. den Computerbildschirm darstellen.
8. Entwerfen Sie die Parameter wie den Fluoreszenzkanal (z. B. Ph-40x, Fluoresceinisothiocyanat [FITC], Shutter) und die erwartete Aufnahmezeit für das Experiment. Stellen Sie die Aufnahmezeit zeitlich ein, einschließlich der Aufnahmeintervallzeit von 5 Minuten zwischen jeweils zwei Bildern und einer Gesamtaufnahmezeit von 6 h.
   Anmerkungen: Für Langzeitaufnahmen muss die Fokusstabilisierungsfunktion des Perfect Focus System (PFS) verwendet werden. Stellen Sie dazu zuerst das Sichtfeld und die Fokuslänge ein, klicken Sie dann auf dem Computerbildschirm auf PFS und stellen Sie schließlich die Feinfokusspirale ein.
9. Wählen Sie verschiedene Kanalmodi aus, einen Kanal oder alle, wählen Sie ein anderes Sichtfeld aus, klicken Sie auf Vorschau, passen Sie das Sichtfeld an, stellen Sie diese Parameter ein und klicken Sie auf Start Running , um die Aufnahme zu starten. Machen Sie zuerst eine Testaufnahme für 5 Minuten; Es kann lange dauern, bis die Operation normal ist.
10. Nachdem die Aufnahme durchgeführt wurde, wählen Sie Datei > Speichern unter, > Speichertyp > AVI-Format , um die Daten in ein Video im AVI-Format zu exportieren. Verwenden Sie das Bildformat '.nd2', um das Datenprogramm zu speichern und die Fotos zu exportieren.
11. Um das Gerät auszuschalten, schalten Sie es in umgekehrter Reihenfolge aus.

5. Statistik und Ergebnisanalyse

1. Analysieren Sie die Daten mithilfe der unidirektionalen ANOVA. Geben Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler an.

Ergebnisse

Die Färbung von Zell-LDs ist in Abbildung 1 dargestellt. Die roten Punkte spiegeln die LDs der Zellen wider, und die blauen Punkte spiegeln die Zellkerne wider. Es ist ersichtlich, dass die Größe und Anzahl der LDs in jedem Bild unter der Behandlung von LA unterschiedlich sind.

Mit der Erhöhung der LA-Dosierung zeigten der durchschnittliche Durchmesser und die Anzahl der LDs einen signifikant ansteigenden Trend, abhängig von der LA-Konzentration (

Diskussion

Abhängig von den pathologischen Zuständen verändern sich die hepatischen LDs enorm in ihrer Größe und Anzahl. LDs sind in Hepatozytenzellen weit verbreitet und spielen eine Schlüsselrolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Leber¹⁸. Die Menge und Größe der LDs sind die Grundlage der aktuellen Forschung zur Biogenese der LDs¹⁹. Die Größe und Anzahl der LDs für Zellen und Gewebe spiegelt ihre Fähigkeit wider, Energie zu speichern und freizusetzen. Die dynamische...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent