Valutazione della dimensione e della fusione delle goccioline lipidiche nelle cellule epatiche bovine

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come utilizzare l'olio rosso O per tingere le goccioline lipidiche (LD), calcolare la dimensione e il numero di LD in un modello di epatociti grassi indotto da acidi grassi e utilizzare BODIPY 493/503 per osservare il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD mediante imaging di cellule vive.

Abstract

Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli che svolgono un ruolo importante nel metabolismo dei lipidi e nella conservazione dei lipidi neutri nelle cellule. Sono associati a una varietà di malattie metaboliche, come l'obesità, la malattia del fegato grasso e il diabete. Nelle cellule epatiche, le dimensioni e il numero di LD sono segni di malattia del fegato grasso. Inoltre, la reazione allo stress ossidativo, l'autofagia cellulare e l'apoptosi sono spesso accompagnate da cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD. Di conseguenza, le dimensioni e la quantità delle LD sono alla base della ricerca attuale sul meccanismo della biogenesi delle LD. Qui, nelle cellule epatiche bovine indotte da acidi grassi, descriviamo come utilizzare l'olio rosso O per colorare le LD e per studiare le dimensioni e il numero di LD. La distribuzione dimensionale delle LD viene analizzata statisticamente. Il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD è anche osservato da un sistema di imaging di cellule vive. Il lavoro attuale fornisce un modo per osservare direttamente la tendenza al cambiamento delle dimensioni dei LD in diverse condizioni fisiologiche.

Introduzione

L'accumulo di goccioline lipidiche (LD) negli epatociti è la caratteristica tipica della steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che può progredire verso la fibrosi epatica e il carcinoma epatocellulare. È stato riscontrato che la prima manifestazione della malattia del fegato grasso è la steatosi, caratterizzata da accumulo di LD nel citoplasma dell'epatocita¹. La steatosi epatica è invariabilmente associata ad un aumento del numero e/o ad una dimensione espansa delle LD². Si ritiene che le LD siano generate dal reticolo endoplasmatico (ER), costituito da trigliceridi (TG) come nucleo, e sono circondate da proteine e fos....

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con gli standard etici del Comitato per la cura degli animali dell'Università agricola di Henan (provincia di Henan, Cina).

1. Coltura cellulare di epatociti bovini

1. Scongelare le cellule epatocitarie primarie¹⁷ e centrifugare 400 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Le cellule epatocitarie primarie sono state coltivate e mantenute a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato¹⁷.
2. Gettare la soluzione congelata con una pipetta e sospenderla con 1 mL di terreno conten....

Discussione

A seconda degli stati patologici, le LD epatiche subiscono enormi cambiamenti nelle loro dimensioni e numero. Le LD sono ampiamente presenti nelle cellule degli epatociti e svolgono un ruolo chiave nella salute e nella malattia del fegato¹⁸. La quantità e la dimensione delle LD sono alla base delle attuali ricerche sulla biogenesi delle LD¹⁹. La dimensione e il numero di LD per cellule e tessuti riflettono la loro capacità di immagazzinare e rilasciare energia. I cambiame.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent