Valutazione della dimensione e della fusione delle goccioline lipidiche nelle cellule epatiche bovine

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come utilizzare l'olio rosso O per tingere le goccioline lipidiche (LD), calcolare la dimensione e il numero di LD in un modello di epatociti grassi indotto da acidi grassi e utilizzare BODIPY 493/503 per osservare il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD mediante imaging di cellule vive.

Abstract

Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli che svolgono un ruolo importante nel metabolismo dei lipidi e nella conservazione dei lipidi neutri nelle cellule. Sono associati a una varietà di malattie metaboliche, come l'obesità, la malattia del fegato grasso e il diabete. Nelle cellule epatiche, le dimensioni e il numero di LD sono segni di malattia del fegato grasso. Inoltre, la reazione allo stress ossidativo, l'autofagia cellulare e l'apoptosi sono spesso accompagnate da cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD. Di conseguenza, le dimensioni e la quantità delle LD sono alla base della ricerca attuale sul meccanismo della biogenesi delle LD. Qui, nelle cellule epatiche bovine indotte da acidi grassi, descriviamo come utilizzare l'olio rosso O per colorare le LD e per studiare le dimensioni e il numero di LD. La distribuzione dimensionale delle LD viene analizzata statisticamente. Il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD è anche osservato da un sistema di imaging di cellule vive. Il lavoro attuale fornisce un modo per osservare direttamente la tendenza al cambiamento delle dimensioni dei LD in diverse condizioni fisiologiche.

Introduzione

L'accumulo di goccioline lipidiche (LD) negli epatociti è la caratteristica tipica della steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che può progredire verso la fibrosi epatica e il carcinoma epatocellulare. È stato riscontrato che la prima manifestazione della malattia del fegato grasso è la steatosi, caratterizzata da accumulo di LD nel citoplasma dell'epatocita¹. La steatosi epatica è invariabilmente associata ad un aumento del numero e/o ad una dimensione espansa delle LD². Si ritiene che le LD siano generate dal reticolo endoplasmatico (ER), costituito da trigliceridi (TG) come nucleo, e sono circondate da proteine e fosfolipidi³. Come organello subcellulare responsabile della conservazione della TG, le LD mostrano caratteristiche diverse per quanto riguarda le loro dimensioni, numero, composizione lipidica, proteine e interazione con altri organelli, che influenzano l'omeostasi energetica cellulare⁴. Il livello di TG è positivamente correlato con le dimensioni delle LD e un contenuto di TG intracellulare più elevato potrebbe formare LD più grandi⁵. Le LD aumentano di dimensioni attraverso la sintesi locale di TG, l'incorporazione lipidica nell'ER e la fusione di più LD⁶. Le cellule (adipociti, epatociti, ecc.) che contengono grandi LD hanno un meccanismo speciale per aumentare efficacemente l'accumulo di lipidi mediante fusione LD. I cambiamenti dinamici delle LD riflettono i diversi stati del metabolismo energetico della cellula. È fondamentale sviluppare metodologie che permettano l'osservazione e l'analisi delle varie LD epatiche in cellule sane e anormali.

I principali coloranti non fluorescenti per LD sono Sudan Black B e rosso olio O. Sudan Black B colora lipidi neutri, fosfolipidi e steroidi⁷. L'olio rosso O viene utilizzato principalmente per la colorazione di LD di muscolo scheletrico, cardiomiociti, tessuto epatico, cellule adipose, ecc⁸., ed è considerato uno strumento standard per la rilevazione quantitativa della steatosi epatica nei topi e nell'uomo⁹. Il cambiamento dinamico delle LD è effettuato principalmente dalla tintura a fluorescenza. Il rosso del Nilo e il BODIPY sono entrambi coloranti lipidici fluorescenti comunemente usati^10,11. Rispetto al rosso del Nilo, BODIPY ha una permeabilità tissutale più forte e si lega meglio con LDs¹². I LD marcati con BODIPY possono essere utilizzati per la colorazione delle cellule viventi e la colocalizzazione con altri organelli¹³.

L'incidenza della steatosi epatica è significativamente più elevata nei ruminanti rispetto agli animali monogastrici¹⁴. Durante il periodo di transizione, le vacche da latte sperimentano uno stato di bilancio energetico negativo³. Grandi quantità di acidi grassi non esterificati (acido palmitico, acido oleico, acido linoleico, ecc.) sono sintetizzate in TG negli epatociti bovini, il che porta ad anomalie funzionali del fegato e riduce notevolmente la qualità dei prodotti lattiero-caseari e l'efficienza produttiva¹⁵. Il presente studio si propone di fornire un protocollo per analizzare la dimensione e il numero di LD, nonché per monitorare la dinamica di fusione LD. Abbiamo costruito un modello di formazione di LD aggiungendo diverse concentrazioni di acido linoleico (LA) negli epatociti¹⁶ e osservato i cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD durante il processo colorando le LD con O rosso olio. Inoltre, il processo di rapida fusione delle LD è stato osservato anche mediante colorazione con BODIPY 493/503.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con gli standard etici del Comitato per la cura degli animali dell'Università agricola di Henan (provincia di Henan, Cina).

1. Coltura cellulare di epatociti bovini

1. Scongelare le cellule epatocitarie primarie¹⁷ e centrifugare 400 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Le cellule epatocitarie primarie sono state coltivate e mantenute a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato¹⁷.
2. Gettare la soluzione congelata con una pipetta e sospenderla con 1 mL di terreno contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM). Quindi, utilizzare una camera di conteggio delle celle per calcolare il numero di celle per millilitro, quindi calcolare la concentrazione della sospensione cellulare di cui sopra e regolare la concentrazione di cellule a 1 x 10⁷ celle / ml.
   1. Aggiungere la sospensione cellulare in un piatto di coltura cellulare da 60 mm contenente 3 ml del mezzo di cui sopra. Coltivare le cellule e incubarle a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.
3. Quando le cellule crescono all'80%, scartare il mezzo e risciacquare con soluzione salina tamponata fosfato (PBS), quindi aggiungere 750 μL di tripsina allo 0,25% per digerire le cellule. Incubare le cellule a 37 °C per 3 minuti, quindi neutralizzarle con la stessa quantità di FBS al 10%. Raccogliere la sospensione cellulare per centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.

2. Colorazione O rosso olio

1. Aggiungere 800 μL di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e DMEM in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti contenente vetrini di copertura. Prelevare 50 μL della sospensione cellulare (ottenuta al punto 1.3) e aggiungerli a 950 μL di PBS per miscelare. Utilizzare una camera di conteggio delle celle per calcolare il numero di celle per millilitro, quindi calcolare la concentrazione della sospensione cellulare di cui sopra. Infine, regolare la concentrazione cellulare a 4 x 10⁴/mL in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 24 ore.
2. Dopo 24 ore, scartare il terreno di coltura e lavare con PBS. Sospendere con 800 μL di terreno di induzione DMEM contenente 1 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA).
3. Sciogliere un totale di 100 μL di LA (vedi Tabella dei materiali) in 900 μL di etanolo anidro e preparare una soluzione standard (100 mmol/L). Aggiungere un gradiente di 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L e 200 μmol/L LA nella piastra a 24 pozzetti. Ripetere ogni trattamento quattro volte. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 24 ore.
4. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS tre volte. Fissare con 400 μL di paraformaldeide al 4% per 20 min. Scartare la soluzione fissativa e lavarla con PBS tre volte.
5. Incubare le cellule con alcool isopropilico al 60% per 5 minuti, quindi scartarlo. Aggiungere la soluzione di lavoro rosso olio O appena preparata (vedere la tabella dei materiali) (rapporto 3:2 di olio rosso O:acqua) per 20-30 minuti ed eliminare la soluzione colorante. Lavare le cellule con PBS da due a cinque volte fino a quando non c'è soluzione colorante in eccesso.
6. Aggiungere 300 μL di soluzione colorante di ematossilina (rapporto ematossilina:acqua di 1:10) e ricolorare il nucleo per 1-2 minuti. Scartare la soluzione colorante e lavare le cellule con PBS da due a cinque volte. Estrarre i vetrini di vetro dalla piastra a 24 pozzetti e posizionarli su vetrini microscopici (il lato con le celle rivolte verso il basso) dopo aver lasciato cadere 10 μL di sigillante per compresse (vedere Tabella dei materiali) sul vetrino.
7. Dopo la sigillatura, osservare e visualizzare i LD delle cellule sotto la lente dell'olio del microscopio ottico (vedi Tabella dei materiali). Misurare il diametro dei LD con il software cellSens e analizzare il numero e la dimensione dei LD.

3. Misurazione delle dimensioni e del numero di LD

1. Acquisizione di immagini: accendere successivamente l'interruttore del computer e del microscopio, posizionare il vetrino sulla piattaforma di carico, aprire il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) e collegare il computer per visualizzare l'immagine.
   1. Trova le immagini a bassa potenza e gocciola una quantità appropriata di olio di cedro sul vetrino di imaging. Regolare il fattore di osservazione a 100x, impostare l'esposizione automatica e acquisire le immagini regolando il campo visivo appropriato. Selezionare tre diapositive di celle colorate per ciascun gruppo per l'imaging.
2. Misurazione del diametro: selezionare casualmente 60 LD per ogni immagine per misurare i diametri. Dopo la misurazione di ciascuna immagine, salvare le immagini e inviare i risultati della misurazione in una tabella per la successiva analisi delle dimensioni medie e del rapporto di distribuzione dei LD.
3. Misurazione della quantità: selezionare tre immagini per ogni diapositiva macchiata e fotografata e selezionare casualmente tre celle per la misurazione della quantità in ogni immagine. Contare e analizzare il numero di LD intorno alla cella e calcolare il numero medio di LD nella cella.

4. Osservazione dinamica della fusione LD

1. Seguire le fasi della coltura cellulare come indicato nei passaggi 1.1-1.3. Quando le cellule crescono fino all'80%, scartare il terreno e risciacquare con PBS, quindi digerirle con 750 μL di tripsina per 3 minuti. Quindi, aggiungere 750 μL del mezzo, centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
2. Sospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura, contare e regolare la concentrazione cellulare a 5 x 10⁵ cellule/ml in un piatto da 35 mm. Coltura a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.
3. Quando le cellule sono cresciute fino all'80%, cambiare il terreno in DMEM + 150 μmol / L LA per 24 ore e continuare la coltura in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ per accumulare le LD.
4. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di coltura. Lavare le cellule aderenti con PBS e incubarle con una sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 da 10 μg/mL (vedi Tabella dei materiali) al buio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule nel piatto di coltura con PBS tre volte e aggiungere DMEM + 150 μmol / L LA.
   NOTA: Evitare l'esposizione alla luce durante e dopo la colorazione BODIPY da 10 μg/ml; 1 mg/mL BODIPY è stato diluito con PBS (1:100).
5. Posizionare il piatto di coltura nella scanalatura del microscopio della stazione cellulare vivente (vedi Tabella dei materiali) per osservare i cambiamenti dinamici dei LD. Accendere l'alimentazione della postazione di lavoro della cellula vivente in base alla sequenza iniziale ed evitare la luce.
   1. Accendere l'alimentazione, la sorgente luminosa di trasmissione, la fonte di alimentazione del microscopio, la sorgente luminosa fluorescente della lampada al mercurio, la fonte di alimentazione della fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD), la fonte di alimentazione dell'host del computer, la valvola CO 2 e l'incubatore di CO₂.
6. Aggiungere acqua distillata alla scanalatura sulla piattaforma di carico, assicurandosi di non andare oltre la presa d'aria.
7. Accendi il computer ed esegui "NIS-Elements". Innanzitutto, trova il campo visivo appropriato sull'obiettivo 4x, quindi regolalo successivamente sull'obiettivo 40x. Selezionare E100 per osservare il campione al microscopio e L100 per visualizzare in anteprima e fotografare il campione sul computer.
   NOTA: E100 e L100 sono pulsanti di regolazione del microscopio sulla postazione di lavoro della cella vivente (vedere la tabella dei materiali), che rappresentano rispettivamente l'oculare e lo schermo del computer.
8. Progettare i parametri come il canale di fluorescenza (ad esempio, Ph-40x, isotiocianato di fluoresceina [FITC], otturatore) e il tempo di ripresa previsto per l'esperimento. Impostare il tempo di scatto in tempo, incluso il tempo di intervallo di ripresa di 5 minuti tra ogni due immagini e un tempo di ripresa totale di 6 ore.
   NOTA: le riprese a lungo termine devono utilizzare la funzione di stabilizzazione della messa a fuoco PFS (Perfect Focus System). Per questo, prima regola il campo visivo e la lunghezza della messa a fuoco, quindi fai clic su PFS sullo schermo del computer e infine regola la spirale di messa a fuoco fine.
9. Selezionare diverse modalità di canale, canale singolo o tutto, selezionare un campo visivo diverso, fare clic sull'anteprima, regolare il campo visivo, impostare questi parametri e fare clic su Avvia corsa per avviare le riprese. Fai un colpo di prova per 5 minuti prima; Può richiedere molto tempo dopo che l'operazione è normale.
10. Dopo aver eseguito le riprese, scegli File > Salva come > Salva tipo > formato avi per esportare i dati in un video in formato 'avi'. Utilizzare il formato immagine '.nd2' per salvare il programma dati ed esportare le foto.
11. Per spegnere la macchina, spegnerla in ordine inverso.

5. Statistiche e analisi dei risultati

1. Analizza i dati utilizzando ANOVA unidirezionale. Segnala i risultati come media ± errore standard.

Risultati

La colorazione delle LD cellulari è mostrata nella Figura 1. I punti rossi riflettono i LD delle cellule e i punti blu riflettono i nuclei. Si può vedere che le dimensioni e il numero di LD in ciascuna immagine sono diversi sotto il trattamento di LA.

Con l'aumento del dosaggio di LA, il diametro medio e il numero di LD hanno mostrato una tendenza significativamente in aumento, a seconda della concentrazione di LA (Figura 2). Come m...

Discussione

A seconda degli stati patologici, le LD epatiche subiscono enormi cambiamenti nelle loro dimensioni e numero. Le LD sono ampiamente presenti nelle cellule degli epatociti e svolgono un ruolo chiave nella salute e nella malattia del fegato¹⁸. La quantità e la dimensione delle LD sono alla base delle attuali ricerche sulla biogenesi delle LD¹⁹. La dimensione e il numero di LD per cellule e tessuti riflettono la loro capacità di immagazzinare e rilasciare energia. I cambiame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent