Évaluation de la taille et de la fusion des gouttelettes lipidiques dans les cellules hépatiques bovines

Résumé

Le présent protocole décrit comment utiliser le rouge d’huile O pour colorer les gouttelettes lipidiques (LD), calculer la taille et le nombre de LD dans un modèle d’hépatocytes gras induits par des acides gras et utiliser BODIPY 493/503 pour observer le processus de fusion de petites LD en grandes LD par imagerie de cellules vivantes.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites qui jouent un rôle important dans le métabolisme des lipides et le stockage des lipides neutres dans les cellules. Ils sont associés à une variété de maladies métaboliques, telles que l’obésité, la stéatose hépatique et le diabète. Dans les cellules hépatiques, la taille et le nombre de TA sont des signes de stéatose hépatique. De plus, la réaction de stress oxydatif, l’autophagie cellulaire et l’apoptose s’accompagnent souvent de changements dans la taille et le nombre de LD. En conséquence, les dimensions et la quantité de ML sont à la base de la recherche actuelle concernant le mécanisme de la biogenèse des ML. Ici, dans les cellules hépatiques bovines induites par les acides gras, nous décrivons comment utiliser le rouge d’huile O pour colorer les LD et pour étudier la taille et le nombre de LD. La distribution par taille des TA est analysée statistiquement. Le processus de fusion de petites LD en grandes LD est également observé par un système d’imagerie de cellules vivantes. Les travaux actuels permettent d’observer directement la tendance au changement de taille des TA dans différentes conditions physiologiques.

Introduction

L’accumulation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les hépatocytes est la caractéristique typique de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), qui peut évoluer vers une fibrose hépatique et un carcinome hépatocellulaire. Il a été constaté que la première manifestation de la stéatose hépatique est la stéatose, caractérisée par une accumulation de LD dans le cytoplasme de l’hépatocytes¹. La stéatose hépatique est invariablement associée à une augmentation du nombre et/ou à une taille accrue des TA². On pense que les LD sont générés à partir du réticulum endoplasmique (RE), constitué de triglycérides (TG) comme noyau, ....

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées et exécutées conformément aux normes éthiques du Comité de protection des animaux de l’Université agricole du Henan (province du Henan, Chine).

1. Culture de cellules hépatocytes bovines

1. Décongeler les cellules hépatocytes primaires¹⁷ et centrifuger 400 x g pendant 4 min à température ambiante.
   REMARQUE : Les cellules hépatocytes primaires ont été cultivées et maintenues à la suite d’un rapport publié antérieurement¹⁷.
2. Jeter la solution d’entreposage congelée à l’aide d’une pipette et la suspendre avec 1 ....

Discussion

Selon les états pathologiques, les TA hépatiques subissent d’énormes changements dans leur taille et leur nombre. Les LD sont largement présents dans les cellules hépatocytes et jouent un rôle clé dans la santé et les maladies du foie¹⁸. La quantité et la taille des TA sont à la base des recherches actuelles sur la biogenèse des DL¹⁹. La taille et le nombre de DL pour les cellules et les tissus reflètent leur capacité à stocker et à libérer de l’énergie.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent