Évaluation de la taille et de la fusion des gouttelettes lipidiques dans les cellules hépatiques bovines

Résumé

Le présent protocole décrit comment utiliser le rouge d’huile O pour colorer les gouttelettes lipidiques (LD), calculer la taille et le nombre de LD dans un modèle d’hépatocytes gras induits par des acides gras et utiliser BODIPY 493/503 pour observer le processus de fusion de petites LD en grandes LD par imagerie de cellules vivantes.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites qui jouent un rôle important dans le métabolisme des lipides et le stockage des lipides neutres dans les cellules. Ils sont associés à une variété de maladies métaboliques, telles que l’obésité, la stéatose hépatique et le diabète. Dans les cellules hépatiques, la taille et le nombre de TA sont des signes de stéatose hépatique. De plus, la réaction de stress oxydatif, l’autophagie cellulaire et l’apoptose s’accompagnent souvent de changements dans la taille et le nombre de LD. En conséquence, les dimensions et la quantité de ML sont à la base de la recherche actuelle concernant le mécanisme de la biogenèse des ML. Ici, dans les cellules hépatiques bovines induites par les acides gras, nous décrivons comment utiliser le rouge d’huile O pour colorer les LD et pour étudier la taille et le nombre de LD. La distribution par taille des TA est analysée statistiquement. Le processus de fusion de petites LD en grandes LD est également observé par un système d’imagerie de cellules vivantes. Les travaux actuels permettent d’observer directement la tendance au changement de taille des TA dans différentes conditions physiologiques.

Introduction

L’accumulation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les hépatocytes est la caractéristique typique de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), qui peut évoluer vers une fibrose hépatique et un carcinome hépatocellulaire. Il a été constaté que la première manifestation de la stéatose hépatique est la stéatose, caractérisée par une accumulation de LD dans le cytoplasme de l’hépatocytes¹. La stéatose hépatique est invariablement associée à une augmentation du nombre et/ou à une taille accrue des TA². On pense que les LD sont générés à partir du réticulum endoplasmique (RE), constitué de triglycérides (TG) comme noyau, et sont entourés de protéines et de phospholipides³. En tant qu’organite subcellulaire responsable du stockage des TG, les LD présentent différentes caractéristiques en ce qui concerne leur taille, leur nombre, leur composition lipidique, leurs protéines et leur interaction avec d’autres organites, qui affectent toutes l’homéostasie énergétique cellulaire⁴. Le niveau de TG est positivement corrélé avec la taille des LD, et une teneur en TG intracellulaire plus élevée pourrait former des DL plus grandes⁵. Les LD augmentent en taille grâce à la synthèse locale de TG, à l’incorporation de lipides dans le RE et à la fusion de plusieurs LDs⁶. Les cellules (adipocytes, hépatocytes, etc.) qui contiennent de grandes LD ont un mécanisme spécial pour augmenter efficacement le stockage des lipides par fusion LD. Les changements dynamiques des LD reflètent les différents états du métabolisme énergétique de la cellule. Il est crucial de développer des méthodologies qui permettent l’observation et l’analyse des différentes LD hépatiques dans les cellules saines et anormales.

Les principaux colorants non fluorescents pour les LD sont le noir B du Soudan et le rouge d’huile O. Le noir B du Soudan colore les lipides neutres, les phospholipides et les stéroïdes⁷. Oil red O est principalement utilisé pour colorer les LD du muscle squelettique, des cardiomyocytes, du tissu hépatique, des cellules adipeuses, etc.⁸., et est considéré comme un outil standard pour la détection quantitative de la stéatose hépatique chez la souris et l’homme⁹. Le changement dynamique des LD est principalement réalisé par teinture par fluorescence. Le rouge du Nil et BODIPY sont tous deux des colorants lipidiques fluorescents^{couramment utilisés 10,11}. Comparé au rouge du Nil, BODIPY a une perméabilité tissulaire plus forte et se lie mieux avec les LDs¹². Les LD marqués BODIPY peuvent être utilisés pour colorer les cellules vivantes et la colocalisation avec d’autres organites¹³.

L’incidence de la stéatose hépatique est significativement plus élevée chez les ruminants que chez les monogastriques¹⁴. Pendant la période de transition, les vaches laitières connaissent un état de bilan énergétique négatif³. De grandes quantités d’acides gras non estérifiés (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, etc.) sont synthétisées en TG dans les hépatocytes bovins, ce qui entraîne une anomalie fonctionnelle du foie et réduit considérablement la qualité des produits laitiers et l’efficacité de la production¹⁵. La présente étude vise à fournir un protocole pour analyser la taille et le nombre de ML, ainsi que pour surveiller la dynamique de fusion des LD. Nous avons construit un modèle de formation de LD en ajoutant différentes concentrations d’acide linoléique (LA) dans les hépatocytes¹⁶ et observé les changements dans la taille et le nombre de LD au cours du processus en colorant les LD avec du rouge d’huile O. En outre, le processus de fusion rapide des LD a également été observé par coloration avec BODIPY 493/503.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées et exécutées conformément aux normes éthiques du Comité de protection des animaux de l’Université agricole du Henan (province du Henan, Chine).

1. Culture de cellules hépatocytes bovines

1. Décongeler les cellules hépatocytes primaires¹⁷ et centrifuger 400 x g pendant 4 min à température ambiante.
   REMARQUE : Les cellules hépatocytes primaires ont été cultivées et maintenues à la suite d’un rapport publié antérieurement¹⁷.
2. Jeter la solution d’entreposage congelée à l’aide d’une pipette et la suspendre avec 1 mL de milieu contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco (DMEM). Ensuite, utilisez une chambre de comptage de cellules pour calculer le nombre de cellules par millilitre, puis calculez la concentration de la suspension cellulaire ci-dessus et ajustez la concentration de la cellule à 1 x 10⁷ cellules / mL.
   1. Ajouter la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm contenant 3 mL du milieu ci-dessus. Culture des cellules et incuber à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 24 h.
3. Lorsque les cellules atteignent 80%, jetez le milieu et rincez avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajoutez 750 μL de trypsine à 0,25% pour digérer les cellules. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 min, puis les neutraliser avec la même quantité de FBS à 10%. Recueillir la suspension cellulaire pour centrifuger à 200 x g pendant 4 min à température ambiante.

2. Coloration O rouge huile

1. Ajouter 800 μL de milieu de culture contenant 10 % de FBS et de DMEM dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits contenant des lamelles de verre. Prélever 50 μL de la suspension cellulaire (obtenue à l’étape 1.3) et l’ajouter à 950 μL de PBS à mélanger. Utilisez une chambre de comptage de cellules pour calculer le nombre de cellules par millilitre, puis calculez la concentration de la suspension cellulaire ci-dessus. Enfin, ajuster la concentration cellulaire à 4 x 10⁴/mL dans chaque puits et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
2. Après 24 h, jeter le milieu de culture et laver avec du PBS. Suspendre avec 800 μL de milieu d’induction DMEM contenant 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA).
3. Dissoudre un total de 100 μL d’AL (voir le tableau des matières) dans 900 μL d’éthanol anhydre et préparer une solution étalon (100 mmol/L). Ajouter un gradient de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L et 200 μmol/L LA dans la plaque de 24 puits. Répétez chaque traitement quatre fois. Incuber à 37 °C et 5% de_CO2 pendant 24 h.
4. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixer avec 400 μL de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min. Jetez la solution fixatrice et lavez-la trois fois avec du PBS.
5. Incuber les cellules avec de l’alcool isopropylique à 60% pendant 5 min, puis les jeter. Ajouter la solution de travail O rouge huile fraîchement préparée (voir le tableau des matériaux) (rapport 3:2 d’huile rouge O:eau) pendant 20-30 min et jeter la solution de coloration. Lavez les cellules avec du PBS deux à cinq fois jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’excès de solution de colorant.
6. Ajouter 300 μL de solution de coloration à l’hématoxyline (rapport hématoxyline:eau de 1:10) et re-teindre le noyau pendant 1-2 min. Jetez la solution de colorant et lavez les cellules avec du PBS deux à cinq fois. Retirez les lamelles de verre de la plaque de 24 puits et placez-les sur des lames microscopiques (le côté avec les cellules tournées vers le bas) après avoir déposé 10 μL de mastic pour comprimés (voir le tableau des matériaux) sur la lame.
7. Après le scellement, observer et imager les LD des cellules sous la lentille à huile du microscope optique (voir Tableau des matériaux). Mesurez le diamètre des LD à l’aide du logiciel cellSens et analysez le nombre et la taille des LD.

3. Mesure de la taille et du nombre de TA

1. Capturer des images : Allumez successivement l’ordinateur et l’interrupteur du microscope, placez la lame sur la plate-forme de chargement, ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux) et connectez l’ordinateur pour visualiser l’image.
   1. Trouvez les images à faible puissance et versez une quantité appropriée d’huile de cèdre sur la lame d’imagerie. Ajustez le facteur d’observation à 100x, réglez l’exposition automatique et capturez les images en ajustant le champ de vision approprié. Sélectionnez trois lames de cellules colorées pour chaque groupe à des fins d’imagerie.
2. Mesure du diamètre : sélectionnez au hasard 60 LD pour chaque image afin de mesurer les diamètres. Après la mesure de chaque image, enregistrez les images et extrayez les résultats de la mesure dans un tableau pour l’analyse ultérieure de la taille moyenne et du rapport de distribution des LD.
3. Mesure de la quantité : sélectionnez trois images pour chaque diapositive colorée et photographiée, et sélectionnez au hasard trois cellules pour mesurer la quantité dans chaque image. Comptez et analysez le nombre de TA autour de la cellule, et calculez le nombre moyen de LD dans la cellule.

4. Observation dynamique de la fusion LD

1. Suivez les étapes de culture cellulaire mentionnées aux étapes 1.1-1.3. Lorsque les cellules atteignent 80%, jetez le milieu et rincez avec du PBS, puis digérez-les avec 750 μL de trypsine pendant 3 min. Ensuite, ajoutez 750 μL du milieu, centrifugez à 200 x g pendant 4 min à température ambiante et jetez le surnageant.
2. Suspendre les cellules dans 1 mL de milieu de culture, compter et ajuster la concentration cellulaire à 5 x 10⁵ cellules/mL dans une boîte de 35 mm. Culture à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
3. Lorsque les cellules ont atteint 80%, changer le milieu en DMEM + 150 μmol/L LA pendant 24 h, et poursuivre la culture dans un incubateur à 37°C et 5% CO₂ pour accumuler les LDs.
4. Après 24 h, retirer le milieu de culture. Lavez les cellules adhérentes avec du PBS et incuber avec une sonde fluorescente neutre BODIPY 493/503 de 10 μg/mL (voir le tableau des matériaux) dans l’obscurité pendant 30 min. Après l’incubation, laver les cellules dans la boîte de culture avec du PBS trois fois et ajouter DMEM + 150 μmol/L LA.
   REMARQUE : Éviter l’exposition à la lumière pendant et après la coloration BODIPY à 10 μg/mL; BODIPY à 1 mg/mL a été dilué avec du PBS (1:100).
5. Placez la capsule de culture dans la rainure du microscope de la station de cellules vivantes (voir Tableau des matériaux) pour observer les changements dynamiques des TA. Allumez l’alimentation du poste de travail de la cellule vivante en fonction de la séquence de départ et évitez la lumière.
   1. Mettez sous tension l’alimentation, la source lumineuse de transmission, la source d’alimentation du microscope, la source de lumière fluorescente à lampe au mercure, la source d’alimentation de la caméra à couplage de charge (CCD), la source d’alimentation hôte de l’ordinateur, la vanne CO 2 et l’incubateur de CO₂ .
6. Ajoutez de l’eau distillée à la rainure sur la plate-forme de chargement, en veillant à ne pas passer par-dessus l’évent d’aération.
7. Allumez l’ordinateur et exécutez « NIS-Elements ». Tout d’abord, trouvez le champ de vision approprié sur l’objectif 4x, puis ajustez-le successivement sur l’objectif 40x. Sélectionnez E100 pour observer l’échantillon au microscope et L100 pour prévisualiser et photographier l’échantillon sur l’ordinateur.
   REMARQUE : E100 et L100 sont des boutons de réglage du microscope sur le poste de travail de la cellule vivante (voir le tableau des matériaux), représentant respectivement l’oculaire et l’écran d’ordinateur.
8. Concevoir les paramètres tels que le canal de fluorescence (p. ex., Ph-40x, isothiocyanate de fluorescéine [FITC], obturateur) et le temps de prise de vue prévu pour l’expérience. Réglez le temps de prise de vue dans le temps, y compris l’intervalle de prise de vue de 5 minutes entre deux images et un temps de prise de vue total de 6 h.
   REMARQUE: La prise de vue de longue durée doit utiliser la fonction de stabilisation de mise au point parfaite (PFS). Pour cela, ajustez d’abord le champ de vision et la longueur de mise au point, puis cliquez sur PFS sur l’écran de l’ordinateur, et enfin ajustez la spirale de mise au point fine.
9. Sélectionnez différents modes de chaîne, un seul canal ou tous, sélectionnez un champ de vision différent, cliquez sur Aperçu, ajustez le champ de vision, définissez ces paramètres et cliquez sur Démarrer l’exécution pour commencer la prise de vue. Faites d’abord un essai pendant 5 minutes; Cela peut prendre beaucoup de temps après que l’opération est normale.
10. Une fois la prise de vue effectuée, choisissez Fichier > Enregistrer sous > Enregistrer le type > format avi pour exporter les données vers une vidéo au format 'avi'. Utilisez le format d’image '.nd2' pour enregistrer le programme de données et exporter les photos.
11. Pour éteindre la machine, éteignez-la dans l’ordre inverse.

5. Statistiques et analyse des résultats

1. Analysez les données à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle. Déclarez les résultats sous forme de moyenne ±erreur-type.

Résultats

La coloration des LD cellulaires est illustrée à la figure 1. Les points rouges reflètent les LD cellulaires et les points bleus reflètent les noyaux. On peut voir que la taille et le nombre de TA dans chaque image sont différents sous le traitement de LA.

Avec l’augmentation de la dose d’AL, le diamètre moyen et le nombre de DL ont montré une tendance à la hausse significative, en fonction de la concentration de LA (Figure 2

Discussion

Selon les états pathologiques, les TA hépatiques subissent d’énormes changements dans leur taille et leur nombre. Les LD sont largement présents dans les cellules hépatocytes et jouent un rôle clé dans la santé et les maladies du foie¹⁸. La quantité et la taille des TA sont à la base des recherches actuelles sur la biogenèse des DL¹⁹. La taille et le nombre de DL pour les cellules et les tissus reflètent leur capacité à stocker et à libérer de l’énergie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent