הערכת גודל טיפות שומנים ואיחוי בתאי כבד בקר

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי לצבוע טיפות שומנים (LDs), לחשב את הגודל והמספר של LDs במודל הפטוציטים שומניים המושרה על ידי חומצות שומן, ולהשתמש ב- BODIPY 493/503 כדי לצפות בתהליך של LDs קטנים המתמזגים ל- LDs גדולים על ידי הדמיה של תאים חיים.

Abstract

טיפות שומנים (LDs) הן אברונים הממלאים תפקיד חשוב בחילוף חומרים של שומנים ובאחסון שומנים נייטרלי בתאים. הם קשורים למגוון מחלות מטבוליות, כגון השמנת יתר, מחלת כבד שומני וסוכרת. בתאי כבד, הגדלים והמספרים של LDs הם סימנים למחלת כבד שומני. יתר על כן, תגובת העקה החמצונית, אוטופגיה של תאים ואפופטוזיס מלווים לעתים קרובות בשינויים בגדלים ובמספרים של LDs. כתוצאה מכך, הממדים והכמות של LDs הם הבסיס למחקר הנוכחי לגבי המנגנון של ביוגנזה של LD. כאן, בתאי כבד בקר המושרים על ידי חומצות שומן, אנו מתארים כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי להכתים LDs ולחקור את הגדלים והמספרים של LDs. התפלגות הגודל של LDs מנותחת סטטיסטית. התהליך של התמזגות LDs קטנים לתוך LDs גדולים נצפה גם על ידי מערכת הדמיה של תאים חיים. העבודה הנוכחית מספקת דרך לצפות ישירות במגמת שינוי הגודל של LDs בתנאים פיזיולוגיים שונים.

Introduction

הצטברות טיפות שומנים (LD) בהפטוציטים היא המאפיין האופייני של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), אשר יכולה להתקדם לפיברוזיס בכבד וקרצינומה הפטוצלולרית. נמצא כי הביטוי המוקדם ביותר של מחלת כבד שומני הוא סטאטוזיס, המאופיין הצטברות LD בציטופלסמה של הפטוציטים¹. סטאטוזיס בכבד קשורה תמיד למספר מוגבר ו / או גודל מורחב של LDs². LDs נחשבים להיווצר מן הרשתית האנדופלסמית (ER), המורכבת טריגליצרידים (TG) כמו הליבה, והם מוקפים חלבונים ופוספוליפידים³. כאברונים תת-תאיים האחראים על אחסון TG, LDs מפגינים תכונות שונות לגבי גודלם, מספרם, הרכב השומנים, חלבונים ואינטראקציה עם אברונים אחרים, שכולם משפיעים על הומאוסטזיס אנרגיית התא⁴. רמת TG מתואמת באופן חיובי עם גודל LDs, ותכולת TG תוך-תאית גבוהה יותר יכולה ליצור LDs⁵ גדולים יותר. LDs גדלים באמצעות סינתזה מקומית של TG, שילוב שומנים בחדר המיון, ואיחוי של LDs^{מרובים 6}. תאים (אדיפוציטים, הפטוציטים וכו ') המכילים LDs גדולים יש מנגנון מיוחד כדי להגדיל ביעילות את אחסון השומנים על ידי היתוך LD. השינויים הדינמיים של LDs משקפים את מצבי חילוף החומרים השונים של האנרגיה של התא. חיוני לפתח מתודולוגיות המאפשרות תצפית וניתוח של LDs שונים בכבד בתאים בריאים ולא תקינים.

הצבעים העיקריים שאינם פלואורסצנטיים עבור LDs הם סודן שחור B ואדום שמן O. סודן שחור B כתמים שומנים ניטרליים, פוספוליפידים וסטרואידים⁷. שמן אדום O משמש בעיקר להכתמת LDs של שרירי השלד, קרדיומיוציטים, רקמת כבד, תאי שומן וכו '⁸., ונחשב לכלי סטנדרטי לזיהוי כמותי של סטאטוזיס בכבד בעכברים ובבני אדם⁹. השינוי הדינמי של LDs מתבצע בעיקר על ידי צביעה פלואורסצנטית. אדום הנילוס ו BODIPY הם שניהם צבעי שומנים פלואורסצנטיים^{נפוצים 10,11}. בהשוואה לאדום הנילוס, ל-BODIPY יש חדירות רקמות חזקה יותר והוא נקשר טוב יותר עם LDs¹². LDs המסומנים BODIPY יכולים לשמש להכתמת תאים חיים וקולוקליזציה עם אברונים אחרים¹³.

שכיחות מחלת כבד שומני גבוהה משמעותית בבעלי חיים מעלי גירה מאשר בבעלי חיים חד-קיבתיים¹⁴. במהלך תקופת המעבר, פרות חולבות חוות מצב של מאזן אנרגיה שלילי³. כמויות גדולות של חומצות שומן לא אסטריות (חומצה פלמיטית, חומצה אולאית, חומצה לינולאית וכו ') מסונתזות ל- TGs בהפטוציטים של בקר, מה שמוביל להפרעות תפקודיות בכבד ומקטין מאוד את איכות מוצרי החלב ואת יעילות הייצור¹⁵. המחקר הנוכחי נועד לספק פרוטוקול לניתוח הגודל והמספר של LDs, כמו גם לפקח על דינמיקת היתוך LD. בנינו מודל של היווצרות LD על ידי הוספת ריכוזים שונים של חומצה לינולאית (LA) בהפטוציטים¹⁶ וצפינו בשינויים בגודל ובמספר LDs במהלך התהליך על ידי צביעת LDs עם שמן אדום O. בנוסף, תהליך האיחוי המהיר של LDs נצפה גם על ידי צביעה עם BODIPY 493/503.

Protocol

כל הנהלים אושרו ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של הנאן (מחוז הנאן, סין).

1. תרבית תאי הפטוציטים של בקר

1. הפשיר את תאי הפטוציטים העיקריים¹⁷ ואת הצנטריפוגה 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: תאי הפטוציטים הראשוניים גודלו בתרבית ונשמרו בעקבות דו"ח¹⁷ שפורסם בעבר.
2. השליכו את תמיסת האחסון הקפואה עם פיפטה והשהו אותה עם 1 מ"ל של מדיום המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ומדיום הנשר של דולבקו (DMEM). לאחר מכן, השתמש בתא ספירת תאים כדי לחשב את מספר התאים למיליליטר, ולאחר מכן חשב את ריכוז תרחיף התאים לעיל והתאם את ריכוז התא ל 1 x 10⁷ תאים / מ"ל.
   1. הוסף את תרחיף התא לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המכילה 3 מ"ל של התווך הנ"ל. תרבית את התאים ודגרה אותם ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 שעות.
3. כאשר התאים גדלים ל-80%, יש להשליך את המדיום ולשטוף במי מלח חוצצי פוספט (PBS), ולאחר מכן להוסיף 750 μL של 0.25% טריפסין כדי לעכל את התאים. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 3 דקות, ולאחר מכן לנטרל אותם עם אותה כמות של 10% FBS. אספו את מתלה התא לצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.

2. שמן אדום O כתמים

1. הוסף 800 μL של מדיום תרבית המכיל 10% FBS ו- DMEM לכל באר של צלחת תרבית תאים 24 בארות המכילה כיסויי זכוכית. קח 50 μL של תרחיף התא (מתקבל בשלב 1.3) ולהוסיף אותו 950 μL של PBS כדי לערבב. השתמש בתא ספירת תאים כדי לחשב את מספר התאים למיליליטר, ולאחר מכן חשב את ריכוז תרחיף התאים לעיל. לבסוף, להתאים את ריכוז התא ל 4 x 10⁴ / מ"ל בכל באר לדגור ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 שעות.
2. לאחר 24 שעות, השליכו את מדיום התרבית ושטפו עם PBS. יש להשהות עם 800 μL של מדיום השראת DMEM המכיל אלבומין בסרום בקר (BSA) במינון 1 מ"ג/מ"ל.
3. להמיס סך של 100 μL של LA (ראה טבלה של חומרים) ב 900 μL של אתנול נטול מים ולהכין פתרון סטנדרטי (100 mmol / L). הוסף שיפוע של 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L ו-200 μmol/L LA לצלחת בעלת 24 הקידוחים. חזור על כל טיפול ארבע פעמים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 24 שעות.
4. הסר את מדיום התרבית ושטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן עם 400 μL של 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות. השליכו את התמיסה המקבעת ושטפו אותה עם PBS שלוש פעמים.
5. לדגור על התאים עם 60% אלכוהול איזופרופיל במשך 5 דקות, ולאחר מכן להשליך אותו. מוסיפים תמיסת עבודה טרייה שהוכנה בשמן אדום O (ראו טבלת חומרים) (יחס של 3:2 שמן אדום O:water) למשך 20-30 דקות ומשליכים את תמיסת הצביעה. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים עד חמש פעמים עד שאין תמיסת צבע עודפת.
6. הוסף 300 μL של תמיסת צביעת hematoxylin (hematoxylin: יחס מים של 1:10) וצבע מחדש את הגרעין למשך 1-2 דקות. השליכו את תמיסת הצבע ושטפו את התאים עם PBS פעמיים עד חמש פעמים. הוציאו את כיסויי הזכוכית מהצלחת בעלת 24 הקידוחים והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופיות (הצד עם התאים פונים כלפי מטה) לאחר הטלת 10 מיקרוליטר של חומר איטום טבליות (ראו טבלת חומרים) על המגלשה.
7. לאחר האיטום, התבוננו ודמיינו את ה-LDs של התאים מתחת לעדשת השמן של המיקרוסקופ האופטי (ראו טבלת חומרים). למדוד את הקוטר של LDs על ידי תוכנת cellSens ולנתח את המספר והגודל של LDs.

3. מדידת גודל ומספר LDs

1. לכידת תמונות: הפעל את המחשב ואת מתג המיקרוסקופ ברצף, מקם את השקופית על פלטפורמת הטעינה, פתח את תוכנת ניתוח התמונות (ראה טבלת חומרים) וחבר את המחשב כדי להציג את התמונה.
   1. מצא את התמונות בעוצמה נמוכה וטפטף כמות מתאימה של שמן ארז על שקופית ההדמיה. התאם את גורם התצפית ל- 100x, הגדר חשיפה אוטומטית ולכוד את התמונות על ידי התאמת שדה הראייה המתאים. בחר שלוש שקופיות תאים מוכתמים עבור כל קבוצה להדמיה.
2. מדידת קוטר: בחר באופן אקראי 60 LDs לכל תמונה כדי למדוד את הקטרים. לאחר המדידה של כל תמונה, שמור את התמונות והפק את תוצאות המדידה בטבלה לניתוח הבא של הגודל הממוצע ויחס ההתפלגות של LDs.
3. מדידת כמות: בחר שלוש תמונות לכל שקופית מוכתמת ומצולמת, ובחר באופן אקראי שלושה תאים למדידת כמות בכל תמונה. ספור ונתח את מספר LDs סביב התא, וחשב את המספר הממוצע של LDs בתא.

4. תצפית דינמית של היתוך LD

1. בצע את השלבים לתרבית תאים כפי שהוזכר בשלבים 1.1-1.3. כאשר התאים גדלים ל 80%, להשליך את המדיום ולשטוף עם PBS, ולאחר מכן לעכל אותם עם 750 μL של טריפסין במשך 3 דקות. לאחר מכן, להוסיף 750 μL של בינוני, צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
2. להשהות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית, לספור, ולהתאים את ריכוז התא ל 5 x 10⁵ תאים / מ"ל בצלחת 35 מ"מ. תרבית ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 שעות.
3. כאשר התאים גדלו ל 80%, לשנות את המדיום ל DMEM + 150 μmol / L LA במשך 24 שעות, ולהמשיך את התרבית באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂ לצבור LDs.
4. לאחר 24 שעות, הסר את מדיום התרבות. שטפו את התאים הדבקים עם PBS ודגרו עליהם עם 10 מיקרוגרם/מ"ל BODIPY 493/503 בדיקה פלואורסצנטית נייטרלית (ראו טבלת חומרים) בחושך למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים בצלחת תרבית עם PBS שלוש פעמים ולהוסיף DMEM + 150 μmol / L LA.
   הערה: יש להימנע מחשיפה לאור במהלך ולאחר צביעת BODIPY של 10 מיקרוגרם/מ"ל; 1 מ"ג / מ"ל BODIPY היה מדולל עם PBS (1:100).
5. הניחו את צלחת התרבית בחריץ המיקרוסקופ של תחנת התא החי (ראו טבלת חומרים) כדי לצפות בשינויים הדינמיים של LDs. הפעילו את עוצמת תחנת העבודה של התא החי בהתאם לרצף ההתחלה והימנעו מאור.
   1. הפעל את החשמל, מקור אור השידור, מקור כוח המיקרוסקופ, מקור אור פלואורסצנטי של מנורת כספית, מקור כוח מצלמה של התקן מצומד טעינה (CCD), מקור כוח מארח המחשב, שסתום CO 2 ואינקובטור CO₂ .
6. הוסיפו מים מזוקקים לחריץ ברציף ההעמסה, והבטיחו שלא לעבור את פתח האוורור.
7. הפעל את המחשב והפעל את "NIS-Elements". ראשית, מצא את שדה הראייה המתאים בעדשת 4x אובייקטיבית, ולאחר מכן התאם אותו לעדשת 40x אובייקטיבית ברצף. בחר E100 לתצפית על הדגימה במיקרוסקופ ו- L100 לתצוגה מקדימה וצילום הדגימה במחשב.
   הערה: E100 ו-L100 הם לחצני כוונון מיקרוסקופ בתחנת העבודה של התא החי (ראו טבלת חומרים), המייצגים את העינית ואת מסך המחשב, בהתאמה.
8. תכנן את הפרמטרים כגון ערוץ פלואורסצנטי (למשל, Ph-40x, Fluorescein isothiocyanate [FITC], תריס) וזמן הצילום הצפוי לניסוי. הגדר את זמן הצילום בזמן, כולל זמן מרווח הצילום של 5 דקות בין כל שתי תמונות וזמן צילום כולל של 6 שעות.
   הערה: צילום לאורך זמן צריך להשתמש בפונקציית ייצוב המיקוד של מערכת המיקוד המושלמת (PFS). לשם כך, תחילה להתאים את שדה הראייה ואת אורך המיקוד, ולאחר מכן לחץ על PFS על מסך המחשב, ולבסוף להתאים את ספירלת המיקוד העדינה.
9. בחר מצבי ערוץ שונים, ערוץ יחיד או כולם, בחר שדה ראייה אחר, לחץ על תצוגה מקדימה, התאם את שדה הראייה, הגדר פרמטרים אלה ולחץ על התחל לרוץ כדי להתחיל לצלם. קח צילום מבחן במשך 5 דקות הראשון; זה יכול לקחת זמן רב לאחר הניתוח הוא נורמלי.
10. לאחר ביצוע הצילום, בחר קובץ > שמירה בשם > שמור הקלד > פורמט avi כדי לייצא את הנתונים לסרטון בפורמט 'avi'. השתמש בפורמט התמונה '.nd2' כדי לשמור את תוכנית הנתונים ולייצא את התמונות.
11. לכיבוי המכשיר, כבה אותו בסדר הפוך.

5. סטטיסטיקה וניתוח תוצאות

1. נתח את הנתונים באמצעות ANOVA חד-כיוונית. דווח על התוצאות כממוצע ± שגיאת תקן.

תוצאות

הצביעה של תאי LDs מוצגת באיור 1. הנקודות האדומות משקפות LDs של תאים, והנקודות הכחולות משקפות את הגרעינים. ניתן לראות כי הגודל והמספר של LDs בכל תמונה שונים תחת הטיפול של לוס אנג'לס.

עם העלייה במינון LA, הקוטר הממוצע והמספר של LDs הראו מגמת עלייה משמעותית, בהתאם לריכוז ...

Discussion

בהתאם למצבים פתולוגיים, LDs בכבד עוברים שינויים עצומים בגודל ובמספר. LDs נמצאים באופן נרחב בתאי הפטוציטים וממלאים תפקיד מפתח בבריאות הכבד ובמחלות¹⁸. הכמות והגודל של LDs הם הבסיס למחקר הנוכחי על הביוגנזה של LDs¹⁹. הגודל והמספר של LDs עבור תאים ורקמות משקפים את יכולתם לאחסן ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent