牛肝细胞中脂滴大小和融合的评估

摘要

本协议描述了如何使用油红O染色脂滴（LDs），计算脂肪酸诱导的脂肪肝细胞模型中LDs的大小和数量，并使用BODIPY 493 / 503观察小LDs通过活细胞成像融合成大LD的过程。

摘要

脂滴（LD）是在细胞中的脂质代谢和中性脂质储存中起重要作用的细胞器。它们与多种代谢疾病有关，如肥胖、脂肪肝和糖尿病。在肝细胞中，LD的大小和数量是脂肪肝疾病的征兆。此外，氧化应激反应、细胞自噬和细胞凋亡通常伴随着LDs的大小和数量的变化。因此，LDs的尺寸和数量是目前LD生物发生机制研究的基础。在这里，在脂肪酸诱导的牛肝细胞中，我们描述了如何使用油红O来染色LD并研究LD的大小和数量。对LDs的大小分布进行统计分析。活细胞成像系统也观察到小LD融合成大LD的过程。本工作为直接观察不同生理条件下LDs的大小变化趋势提供了一种途径。

引言

脂滴（LD）在肝细胞中的积累是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的典型特征，可进展为肝纤维化和肝细胞癌。已经发现脂肪肝疾病的最早表现是脂肪变性，其特征是LD在肝细胞1的细胞质中蓄^积。肝脂肪变性总是与LDs的数量增加和/或扩大有关²。LD被认为是由内质网（ER）产生的，由甘油三酯（TG）作为核心组成，并被蛋白质和磷脂^包围3。作为负责TG储存的亚细胞器，LDs在大小，数量，脂质组成，蛋白质以及与其他细胞器的相互作用方面表现出不同的特征，所有这些都会影响细胞能量稳态⁴。TG水平与LDs的大小呈正相关，较高的细胞内TG含量可以形成更大的^LDs5。LD通过TG的局部合成，ER中的脂质掺入以及^多个LD的融合而增加尺寸6。含有大LD的细胞（脂肪细胞，肝细胞等）具有通过LD融合有效增加脂质储存的特殊机制。LDs的动态变化反映了细胞不同的能量代谢状态。开发能够观察和分析健康和异常细胞中各种肝LD的方法至关重要。

LDs的主要非荧光染料是苏丹黑B和油红O.苏丹黑B染色中性脂质，磷脂和类固醇⁷。油红O主要用于骨骼肌、心肌细胞、肝组织、脂肪细胞等LD染色^8.，被认为是定量检测小鼠和人类肝脂肪变性的标准工具⁹。LDs的动态变化主要通过荧光染色进行。尼罗红和BODIPY都是常用的荧光脂质染料^10,11。与尼罗河红相比，BODIPY具有更强的组织通透性，与LDs¹²结合更好。BODIPY标记的LD可用于活细胞染色和与其他细胞器共定位¹³。

反刍动物脂肪肝的发病率明显高于单胃动物¹⁴。在过渡期间，奶牛会经历负能量平衡状态³.牛肝细胞中大量非酯化脂肪酸（棕榈酸、油酸、亚油酸等）合成TGs，导致肝功能异常，大大降低奶制品品质和生产效率¹⁵。本研究旨在提供一种协议来分析LD的大小和数量，以及监测LD融合动力学。通过在肝细胞¹⁶ 中添加不同浓度的亚油酸（LA）构建LD形成模型，并通过用油红O染色LD观察LD在此过程中大小和数量的变化。此外，通过用BODIPY 493/503染色也观察到LDs快速融合的过程。

研究方案

所有程序均按照河南农业大学（中国河南省）动物护理委员会的道德标准进行批准和执行。

1.牛肝细胞培养

1. 解冻原代肝细胞¹⁷ ，并在室温下离心400× g4 分钟。
   注意:原代肝细胞按照先前发表的报告¹⁷进行培养和维持。
2. 用移液管丢弃冷冻储存溶液，并用含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的 1 mL 培养基悬浮。接下来，使用细胞计数室计算每毫升的细胞数，然后计算上述细胞悬液的浓度并将细胞浓度调节为1 x 10⁷ 个细胞/ mL。
   1. 将细胞悬液加入含有3mL上述培养基的60 mm细胞培养皿中。培养细胞并在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
3. 当细胞生长到80%时，丢弃培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，然后加入750μL0.25%胰蛋白酶以消化细胞。将细胞在37°C孵育3分钟，然后用等量的10%FBS中和它们。收集细胞悬液以在室温下以200× g 离心4分钟。

2.油红O染色

1. 将 800 μL 含有 10% FBS 和 DMEM 的培养基加入到含有玻璃盖玻片的 24 孔细胞培养板的每个孔中。取 50 μL 细胞悬液（在步骤 1.3 中获得）并将其加入 950 μL PBS 中混合。使用细胞计数室计算每毫升的细胞数，然后计算上述细胞悬浮液的浓度。最后，将每个孔中的细胞浓度调节至4 x 10^{4 /} mL，并在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
2. 24小时后，丢弃培养基并用PBS洗涤。用含有 1 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 的 800 μL DMEM 诱导培养基悬浮。
3. 将总共 100 μL LA（参见 材料表）溶解在 900 μL 无水乙醇中，并制备标准溶液 （100 mmol/L）。将 0 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L 和 200 μmol/L LA 的梯度添加到 24 孔板中。每次治疗重复四次。在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
4. 取出培养基并用PBS洗涤细胞三次。用 400 μL 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。丢弃固定剂溶液并用PBS洗涤三次。
5. 用60%异丙醇孵育细胞5分钟，然后丢弃。加入新鲜制备的油红O工作溶液（见 材料表）（油红O:水的比例为3:2）20-30分钟，弃去染色溶液。用PBS洗涤细胞两到五次，直到没有多余的染料溶液。
6. 加入 300 μL 苏木精染色溶液（苏木精:水比为 1:10），并将细胞核重新染色 1-2 分钟。丢弃染料溶液并用PBS洗涤细胞两到五次。从 24 孔板中取出玻璃盖玻片，将 10 μL 片剂密封剂（参见 材料表）滴到载玻片上后，将它们放在显微镜载玻片上（细胞朝下的一侧）。
7. 密封后，在光学显微镜的油透镜下观察并成像细胞的LD（参见 材料表）。通过cellSens软件测量LD的直径，并分析LD的数量和大小。

3. LD的大小和数量的测量

1. 拍摄图像:依次打开计算机和显微镜开关，将载玻片放在加载平台上，打开图像分析软件（见 材料表），连接计算机查看图像。
   1. 找到低功率的图像，并在成像载玻片上滴上适量的雪松油。将观察因子调整为100倍，设置自动曝光，并通过调整适当的视野来捕获图像。为每组选择三张染色的细胞载玻片进行成像。
2. 直径测量:为每个图像随机选择 60 个 LD 来测量直径。每幅图像测量完毕后，保存图像并将测量结果输出到表格中，用于后续分析LD的平均尺寸和分布比例。
3. 数量测量:为每张染色和拍照的载玻片选择三张图像，并在每张图片中随机选择三个单元格进行数量测量。计算和分析细胞周围的LD数量，并计算细胞中LD的平均数量。

4. LD融合的动态观测

1. 按照步骤1.1-1.3中提到的细胞培养步骤进行操作。当细胞生长到80%时，丢弃培养基并用PBS冲洗，然后用750μL胰蛋白酶消化3分钟。接下来，加入 750 μL 培养基，在室温下以 200 x g 离心 4 分钟，弃去上清液。
2. 将细胞悬浮在 1 mL 培养基中，计数，并在 35 mm 培养皿中将细胞浓度调节至 5 x 10⁵ 个细胞/mL。在37°C和5%CO₂ 下培养24小时。
3. 当细胞生长到80%时，将培养基更换为DMEM + 150μmol/ L LA24小时，并在37°C和5%CO₂ 的培养箱中继续培养以积累LD。
4. 24小时后，除去培养基。用PBS洗涤贴壁细胞，并用10μg/ mL BODIPY 493 / 503中性荧光探针（参见 材料表）在黑暗中孵育30分钟。孵育后，用PBS洗涤培养皿中的细胞三次，并加入DMEM + 150μmol/ L LA。
   注意:在 10 μg/mL BODIPY 染色期间和之后避免光照;用PBS（1:100）稀释1mg/mL BODIPY。
5. 将培养皿放在活细胞站显微镜的凹槽中（见 材料表），观察LDs的动态变化。 根据启动顺序打开活细胞工作站的电源，避光。
   1. 打开电源、透射光源、显微镜电源、汞灯荧光光源、电荷耦合器件（CCD）相机电源、计算机主机电源、CO₂ 阀门和CO₂ 培养箱。
6. 将蒸馏水添加到装载平台上的凹槽中，确保不要越过通风口。
7. 打开计算机并运行"NIS-Elements"。首先，在4倍物镜上找到合适的视场，然后依次调整到40倍物镜。选择E100用于在显微镜中观察样品，选择L100用于在计算机上预览和拍摄样品。
   注意:E100和L100是活细胞工作站上的显微镜调节按钮（见 材料表），分别代表目镜和计算机屏幕。
8. 设计参数，如荧光通道（例如，Ph-40x，异硫氰酸荧光素[FITC]，快门）和实验的预期拍摄时间。设置拍摄 时间，包括每两张图像之间5分钟的拍摄间隔时间和6小时的总拍摄时间。
   注意:长时间拍摄需要使用完美对焦系统（PFS）对焦稳定功能。为此，首先调整视野和焦距，然后点击电脑屏幕上的 PFS ，最后调整精细对焦螺旋。
9. 选择不同的通道模式，单通道或全部，选择不同的视野，单击 预览，调整视野，设置这些参数，然后单击开始 运行开始 拍摄。先试拍5分钟;操作正常后可能需要很长时间。
10. 执行拍摄后，选择 "文件>另存为">保存类型> avi 格式 将数据导出到"avi"格式的视频中。使用".nd2"图像格式保存数据程序并导出照片。
11. 要关闭机器电源，请按相反顺序将其关闭。

5. 统计和结果分析

1. 使用单因子方差分析分析数据。将结果报告为平均±标准误差。

结果

细胞LD的染色如图 1所示。红点反映细胞LD，蓝点反映细胞核。可以看出，在LA的处理下，每张图片中LD的大小和数量是不同的。

随着LA剂量的增加，LD的平均直径和数量显示出显着增加的趋势，这取决于LA浓度（图2）。如图2A所示，每个细胞的LD数量与不同浓度的 LA呈负相关。100 μmol/L LA处理组每个细胞的中位LD?...

讨论

根据病理状态，肝LD的大小和数量会发生巨大变化。LD广泛存在于肝细胞中，在肝脏健康和疾病中起关键作用¹⁸。LDs的数量和大小是目前^LDs19生物发生研究的基础。细胞和组织LD的大小和数量反映了它们储存和释放能量的能力。LDs的动态变化维持脂质代谢活动的稳定性^20,21。LDs的异常积累发生在各种病理条件下，可能是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent