牛肝细胞中脂滴大小和融合的评估

摘要

本协议描述了如何使用油红O染色脂滴（LDs），计算脂肪酸诱导的脂肪肝细胞模型中LDs的大小和数量，并使用BODIPY 493 / 503观察小LDs通过活细胞成像融合成大LD的过程。

摘要

脂滴（LD）是在细胞中的脂质代谢和中性脂质储存中起重要作用的细胞器。它们与多种代谢疾病有关，如肥胖、脂肪肝和糖尿病。在肝细胞中，LD的大小和数量是脂肪肝疾病的征兆。此外，氧化应激反应、细胞自噬和细胞凋亡通常伴随着LDs的大小和数量的变化。因此，LDs的尺寸和数量是目前LD生物发生机制研究的基础。在这里，在脂肪酸诱导的牛肝细胞中，我们描述了如何使用油红O来染色LD并研究LD的大小和数量。对LDs的大小分布进行统计分析。活细胞成像系统也观察到小LD融合成大LD的过程。本工作为直接观察不同生理条件下LDs的大小变化趋势提供了一种途径。

引言

脂滴（LD）在肝细胞中的积累是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的典型特征，可进展为肝纤维化和肝细胞癌。已经发现脂肪肝疾病的最早表现是脂肪变性，其特征是LD在肝细胞1的细胞质中蓄^积。肝脂肪变性总是与LDs的数量增加和/或扩大有关²。LD被认为是由内质网（ER）产生的，由甘油三酯（TG）作为核心组成，并被蛋白质和磷脂^包围3。作为负责TG储存的亚细胞器，LDs在大小，数量，脂质组成，蛋白质以及与其他细胞器的相互作用方面表现出不同的特征，所有这些都会影响细胞能量稳态⁴。TG水平与LDs的大小呈正相关，较高的细胞内TG含量可以形成更大的^LDs5。LD通过TG的局部合成，ER中的脂质掺入以及^多个LD的融合而增加尺寸6。含有大LD的细胞（脂肪细胞，肝细胞等）具有通过LD融合有效增加脂质储存的特殊机制。LDs的动态变化反映了细胞不同的能量代谢状态。开发能够观察和分析健康和异常细胞中各种肝LD的方法至关重要。

LDs的主要非荧光染料是苏丹黑B和油红O.苏丹黑B染色中性脂质，磷脂和类固醇⁷。油红O主要用于骨骼肌、心肌细胞、肝组织、脂肪细胞等LD染色

研究方案

所有程序均按照河南农业大学（中国河南省）动物护理委员会的道德标准进行批准和执行。

1.牛肝细胞培养

1. 解冻原代肝细胞¹⁷ ，并在室温下离心400× g4 分钟。
   注意：原代肝细胞按照先前发表的报告¹⁷进行培养和维持。
2. 用移液管丢弃冷冻储存溶液，并用含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的 1 mL 培养基悬浮。接下来，使用细胞计数室计算每毫升的细胞数，然后计算上述细胞悬液的浓度并将细胞浓度调节为1 x 10⁷ 个细胞/ mL。
   1. 将细胞悬液加入含有3mL上述培养基的60 mm细胞培养皿中。培养细胞并在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
3. 当细胞生长到80%时，丢弃培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，然后加入750μL0.25%胰蛋白酶以消化细胞。将细胞在37°C孵育3分钟，然后用等量的10%FBS中和它们。收集细胞悬液以在室温下以200× g 离心4分钟。

2.油红O染色

1. 将 800 μ....

讨论

根据病理状态，肝LD的大小和数量会发生巨大变化。LD广泛存在于肝细胞中，在肝脏健康和疾病中起关键作用¹⁸。LDs的数量和大小是目前^LDs19生物发生研究的基础。细胞和组织LD的大小和数量反映了它们储存和释放能量的能力。LDs的动态变化维持脂质代谢活动的稳定性^20,21。LDs的异常积累发生在各种病理条件下，可能是?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent