Оценка размера и слияния липидных капель в клетках печени крупного рогатого скота

Резюме

В настоящем протоколе описывается, как использовать масляный красный O для окрашивания липидных капель (LD), вычислять размер и количество LD в модели жирных гепатоцитов, индуцированной жирными кислотами, и использовать BODIPY 493/503 для наблюдения за процессом слияния малых LD в большие LD с помощью визуализации живых клеток.

Аннотация

Липидные капли (LD) представляют собой органеллы, которые играют важную роль в липидном обмене и хранении нейтральных липидов в клетках. Они связаны с различными метаболическими заболеваниями, такими как ожирение, жировая болезнь печени и диабет. В клетках печени размеры и количество LD являются признаками жировой болезни печени. Более того, реакция окислительного стресса, клеточная аутофагия и апоптоз часто сопровождаются изменениями размеров и количества LD. В результате, размеры и количество ЛД являются основой современных исследований механизма биогенеза ЛД. Здесь, в клетках печени крупного рогатого скота, индуцированных жирными кислотами, мы описываем, как использовать масляный красный O для окрашивания LD и для исследования размеров и количества LD. Статистически проанализировано распределение LD по размерам. Процесс слияния малых LD в большие LD также наблюдается с помощью системы визуализации живых клеток. Текущая работа дает возможность непосредственно наблюдать тенденцию изменения размера LD в различных физиологических условиях.

Введение

Накопление липидных капель (ЛД) в гепатоцитах является типичной характеристикой неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая может прогрессировать до фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Установлено, что самым ранним проявлением жировой болезни печени является стеатоз, характеризующийся накоплением ЛД в цитоплазме гепатоцита¹. Стеатоз печени неизменно связан с увеличением количества и/или увеличением размера^LDs2. Считается, что LD генерируются эндоплазматическим ретикулумом (ER), состоящим из триглицеридов (TG) в качестве ядра, и окружены белками и фосфолипидами³. Как субклеточна....

протокол

Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с этическими стандартами Комитета по уходу за животными Хэнаньского сельскохозяйственного университета (провинция Хэнань, Китай).

1. Культура клеток гепатоцитов крупного рогатого скота

1. Разморозьте первичные клетки гепатоцитов¹⁷ и центрифугу 400 x g в течение 4 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные клетки гепатоцитов культивировали и поддерживали в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹⁷.
2. Откажитесь от замороженного раствора для хранения с помощью пипетки и суспендируйте ....

Результаты

Окрашивание клеточных LD показано на рисунке 1. Красные точки отражают LD клеток, а синие точки отражают ядра. Видно, что размер и количество ЛД на каждом снимке различны при лечении ЛК.

С увеличением дозировки ЛК средний диаметр и количество ЛД показали тенд.......

Обсуждение

В зависимости от патологических состояний печеночные ЛД претерпевают колоссальные изменения в своих размерах и количестве. ЛД широко присутствуют в клетках гепатоцитов и играют ключевую роль в здоровье и заболеваниях печени¹⁸. Количество и размер ЛД лежат в основе соврем?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent