Оценка размера и слияния липидных капель в клетках печени крупного рогатого скота

Резюме

В настоящем протоколе описывается, как использовать масляный красный O для окрашивания липидных капель (LD), вычислять размер и количество LD в модели жирных гепатоцитов, индуцированной жирными кислотами, и использовать BODIPY 493/503 для наблюдения за процессом слияния малых LD в большие LD с помощью визуализации живых клеток.

Аннотация

Липидные капли (LD) представляют собой органеллы, которые играют важную роль в липидном обмене и хранении нейтральных липидов в клетках. Они связаны с различными метаболическими заболеваниями, такими как ожирение, жировая болезнь печени и диабет. В клетках печени размеры и количество LD являются признаками жировой болезни печени. Более того, реакция окислительного стресса, клеточная аутофагия и апоптоз часто сопровождаются изменениями размеров и количества LD. В результате, размеры и количество ЛД являются основой современных исследований механизма биогенеза ЛД. Здесь, в клетках печени крупного рогатого скота, индуцированных жирными кислотами, мы описываем, как использовать масляный красный O для окрашивания LD и для исследования размеров и количества LD. Статистически проанализировано распределение LD по размерам. Процесс слияния малых LD в большие LD также наблюдается с помощью системы визуализации живых клеток. Текущая работа дает возможность непосредственно наблюдать тенденцию изменения размера LD в различных физиологических условиях.

Введение

Накопление липидных капель (ЛД) в гепатоцитах является типичной характеристикой неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая может прогрессировать до фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Установлено, что самым ранним проявлением жировой болезни печени является стеатоз, характеризующийся накоплением ЛД в цитоплазме гепатоцита¹. Стеатоз печени неизменно связан с увеличением количества и/или увеличением размера^LDs2. Считается, что LD генерируются эндоплазматическим ретикулумом (ER), состоящим из триглицеридов (TG) в качестве ядра, и окружены белками и фосфолипидами³. Как субклеточная органелла, ответственная за хранение ТГ, LD проявляют различные особенности в отношении их размера, количества, липидного состава, белков и взаимодействия с другими органеллами, все из которых влияют на энергетический гомеостаз^{клетки 4}. Уровень ТГ положительно коррелирует с размером ЛД, и более высокое внутриклеточное содержание ТГ может образовывать более крупные ЛД⁵. ЛД увеличиваются в размерах за счет локального синтеза ТГ, включения липидов в ЭР и слияния нескольких ЛД⁶. Клетки (адипоциты, гепатоциты и т. д.), содержащие большие ЛД, имеют специальный механизм для эффективного увеличения накопления липидов путем слияния ЛД. Динамические изменения LD отражают различные состояния энергетического метаболизма клетки. Крайне важно разработать методологии, которые позволяют наблюдать и анализировать различные печеночные LD в здоровых и аномальных клетках.

Основными нефлуоресцентными красителями для LD являются суданский черный B и масляный красный O. Sudan Black B окрашивает нейтральные липиды, фосфолипиды и стероиды⁷. Масляный красный O в основном используется для окрашивания LD скелетных мышц, кардиомиоцитов, ткани печени, жировых клеток и т.^{Д. 8}., и считается стандартным инструментом для количественного выявления стеатоза печени у мышей и людей⁹. Динамическое изменение LD в основном осуществляется флуоресцентным окрашиванием. Нильский красный и BODIPY являются широко используемыми флуоресцентными липидными красителями^10,11. По сравнению с нильским красным, BODIPY обладает более сильной проницаемостью для тканей и лучше связывается с LDs¹². LD, меченные BODIPY, могут быть использованы для окрашивания живых клеток и колокализации с другими органеллами¹³.

Заболеваемость жировой болезнью печени значительно выше у жвачных животных, чем у животных с моногастричными желудками¹⁴. В переходный период у дойных коров наблюдается состояние отрицательного энергетического^{баланса3}. Большое количество неэтерифицированных жирных кислот (пальмитиновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота и др.) синтезируется в ТГ в гепатоцитах крупного рогатого скота, что приводит к функциональной патологии печени и значительно снижает качество молочных продуктов и эффективность производства¹⁵. Настоящее исследование направлено на предоставление протокола для анализа размера и количества LD, а также для мониторинга динамики слияния LD. Мы построили модель образования LD путем добавления различных концентраций линолевой кислоты (LA) в гепатоцитах¹⁶ и наблюдали изменения размера и количества LD в процессе, окрашивая LD масляным красным O. Кроме того, процесс быстрого слияния LDs также наблюдался при окрашивании BODIPY 493/503.

протокол

Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с этическими стандартами Комитета по уходу за животными Хэнаньского сельскохозяйственного университета (провинция Хэнань, Китай).

1. Культура клеток гепатоцитов крупного рогатого скота

1. Разморозьте первичные клетки гепатоцитов¹⁷ и центрифугу 400 x g в течение 4 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные клетки гепатоцитов культивировали и поддерживали в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹⁷.
2. Откажитесь от замороженного раствора для хранения с помощью пипетки и суспендируйте его с 1 мл среды, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и модифицированную среду Дульбекко Eagle's (DMEM). Затем используйте камеру подсчета клеток, чтобы рассчитать количество клеток на миллилитр, а затем рассчитайте концентрацию вышеуказанной клеточной суспензии и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 10⁷ клеток / мл.
   1. Добавьте клеточную суспензию в чашку для культивирования клеток диаметром 60 мм, содержащую 3 мл вышеуказанной среды. Культивируют клетки и инкубируют их при 37 °C и 5%_CO2 в течение 24 ч.
3. Когда клетки вырастут до 80%, выбросьте среду и промойте фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), затем добавьте 750 мкл 0,25% трипсина для переваривания клеток. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 3 мин, затем нейтрализуют их таким же количеством 10% FBS. Соберите клеточную суспензию в центрифуге при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.

2. Масляно-красное окрашивание O

1. Добавьте 800 мкл питательной среды, содержащей 10% FBS и DMEM, в каждую лунку 24-луночной пластины для культивирования клеток, содержащей стеклянные покровные стекла. Возьмите 50 мкл клеточной суспензии (полученной на этапе 1.3) и добавьте ее к 950 мкл PBS для перемешивания. Используйте камеру подсчета клеток, чтобы рассчитать количество клеток на миллилитр, а затем рассчитайте концентрацию вышеуказанной суспензии клеток. Наконец, отрегулируйте концентрацию клеток до 4 x 10⁴ / мл в каждой лунке и инкубируйте при 37 ° C и 5% CO₂ в течение 24 часов.
2. Через 24 ч культуральную среду выбросить и промыть ПБС. Суспендировать 800 мкл индукционной среды DMEM, содержащей 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA).
3. Растворите в общей сложности 100 мкл LA (см. Таблицу материалов) в 900 мкл безводного этанола и приготовьте стандартный раствор (100 ммоль/л). Добавьте градиент 0 мкмоль/л, 100 мкмоль/л, 150 мкмоль/л и 200 мкмоль/л LA в 24-луночную пластину. Повторите каждую обработку четыре раза. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 в течение 24 ч.
4. Удалите питательную среду и трижды промойте клетки PBS. Закрепите 400 мкл 4% параформальдегида в течение 20 мин. Откажитесь от фиксирующего раствора и трижды промойте его ПБС.
5. Инкубируйте клетки с 60% изопропиловым спиртом в течение 5 мин, затем выбросьте его. Добавьте свежеприготовленный масляный красный рабочий раствор О (см. Таблицу материалов) (соотношение масляного красного О 3:2) на 20-30 мин и откажитесь от красящего раствора. Промойте клетки PBS от двух до пяти раз, пока не исчезнут излишки раствора красителя.
6. Добавьте 300 мкл раствора для окрашивания гематоксилином (соотношение гематоксилин к воде 1:10) и повторно окрашивайте ядро в течение 1-2 мин. Откажитесь от раствора красителя и промойте клетки PBS от двух до пяти раз. Выньте стеклянные покровные стекла из 24-луночной пластины и поместите их на микроскопические предметные стекла (сторона клетками вниз), капнув на предметное стекло 10 мкл герметика для таблеток (см. Таблицу материалов).
7. После герметизации наблюдайте и визуализируйте LD клеток под масляной линзой оптического микроскопа (см. Таблицу материалов). Измерьте диаметр LD с помощью программного обеспечения cellSens и проанализируйте количество и размер LD.

3. Измерение размера и количества LD

1. Захват изображений: Последовательно включите компьютер и переключатель микроскопа, поместите предметное стекло на загрузочную платформу, откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) и подключите компьютер для просмотра изображения.
   1. Найдите изображения с низким энергопотреблением и капните необходимое количество кедрового масла на слайд изображения. Отрегулируйте коэффициент наблюдения до 100x, установите автоматическую экспозицию и сделайте снимки, отрегулировав соответствующее поле зрения. Выберите три слайда окрашенных ячеек для каждой группы для визуализации.
2. Измерение диаметра: Случайным образом выберите 60 LD для каждого изображения, чтобы измерить диаметры. После измерения каждого изображения сохраните изображения и выведите результаты измерений в таблицу для последующего анализа среднего размера и коэффициента распределения LD.
3. Измерение количества: выберите три изображения для каждого окрашенного и сфотографированного слайда и случайным образом выберите три ячейки для измерения количества на каждом изображении. Подсчитайте и проанализируйте количество LD вокруг ячейки и рассчитайте среднее количество LD в ячейке.

4. Динамическое наблюдение за синтезом ЛД

1. Следуйте шагам культивирования клеток, как указано в шагах 1.1-1.3. Когда клетки вырастут до 80%, выбросьте среду и промойте PBS, затем переварите их 750 мкл трипсина в течение 3 мин. Затем добавьте 750 мкл среды, центрифугу при 200 x g в течение 4 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
2. Суспендируйте клетки в 1 мл питательной среды, подсчитайте и отрегулируйте концентрацию клеток до 5 x^10,5 клеток/мл в чашке диаметром 35 мм. Культивируют при 37 °С и 5%_СО2 в течение 24 ч.
3. Когда клетки вырастут до 80%, меняют среду на DMEM + 150 мкмоль/л LA в течение 24 ч и продолжают культивирование в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ для накопления LD.
4. Через 24 ч удаляют питательную среду. Вымойте адгезивные клетки PBS и инкубируйте их нейтральным флуоресцентным зондом BODIPY 493/503 10 мкг/мл (см. Таблицу материалов) в темноте в течение 30 мин. После инкубации трижды промойте клетки в посуде для культивирования с PBS и добавьте DMEM + 150 мкмоль/л LA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия света во время и после окрашивания BODIPY 10 мкг / мл; 1 мг/мл BODIPY разбавляли PBS (1:100).
5. Поместите чашку для культивирования в канавку микроскопа станции живой клетки (см. Таблицу материалов), чтобы наблюдать за динамическими изменениями LD. Включите питание рабочей станции с живой клеткой в соответствии с начальной последовательностью и избегайте света.
   1. Включите питание, источник пропускающего света, источник питания микроскопа, источник люминесцентного света ртутной лампы, источник питания камеры с зарядовой связью (ПЗС), источник питания хоста компьютера, клапан CO 2 и инкубатор CO₂.
6. Добавьте дистиллированную воду в канавку на грузовой платформе, следя за тем, чтобы она не проходила через вентиляционное отверстие.
7. Включите компьютер и запустите «NIS-Elements». Сначала найдите подходящее поле зрения на 4-кратном объективе, а затем последовательно отрегулируйте его на 40-кратный объектив. Выберите E100 для наблюдения образца в микроскопе и L100 для предварительного просмотра и фотографирования образца на компьютере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: E100 и L100 - это кнопки регулировки микроскопа на рабочей станции с живой клеткой (см. Таблицу материалов), представляющие окуляр и экран компьютера соответственно.
8. Разработайте такие параметры, как канал флуоресценции (например, Ph-40x, изотиоцианат флуоресцеина [FITC], затвор) и ожидаемое время съемки для эксперимента. Установите время съемки во времени, включая интервал съемки 5 минут между каждыми двумя изображениями и общее время съемки 6 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При длительной съемке необходимо использовать функцию стабилизации фокусировки идеальной системы фокусировки (PFS). Для этого сначала отрегулируйте поле зрения и фокусное расстояние, затем нажмите на PFS на экране компьютера и, наконец, отрегулируйте тонкую спираль фокусировки.
9. Выберите различные режимы каналов, один канал или все, выберите другое поле зрения, нажмите «Предварительный просмотр», отрегулируйте поле зрения, установите эти параметры и нажмите « Начать работу », чтобы начать съемку. Сначала сделайте пробный снимок в течение 5 минут; Это может занять много времени после того, как операция станет нормальной.
10. После того, как съемка будет выполнена, выберите «Файл» > «Сохранить как» > «Сохранить тип > формате avi», чтобы экспортировать данные в видео в формате «avi». Используйте формат изображения «.nd2» для сохранения программы данных и экспорта фотографий.
11. Чтобы выключить машину, выключите ее в обратном порядке.

5. Статистика и анализ результатов

1. Анализируйте данные с помощью одностороннего ANOVA. Сообщайте результаты как среднее ± стандартной ошибки.

Результаты

Окрашивание клеточных LD показано на рисунке 1. Красные точки отражают LD клеток, а синие точки отражают ядра. Видно, что размер и количество ЛД на каждом снимке различны при лечении ЛК.

С увеличением дозировки ЛК средний диаметр и количество ЛД показали тенд...

Обсуждение

В зависимости от патологических состояний печеночные ЛД претерпевают колоссальные изменения в своих размерах и количестве. ЛД широко присутствуют в клетках гепатоцитов и играют ключевую роль в здоровье и заболеваниях печени¹⁸. Количество и размер ЛД лежат в основе соврем?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent