ウシ肝細胞における脂肪滴サイズと融合の評価

要約

本プロトコルでは、オイルレッドOを使用して脂肪滴(LD)を染色する方法、脂肪酸誘発脂肪肝細胞モデルでLDのサイズと数を計算する方法、およびBODIPY 493/503を使用して小さなLDが大きなLDに融合するプロセスを観察する方法について説明しますライブセルイメージングによる。

要約

脂肪滴(LD)は、細胞内の脂質代謝および中性脂質貯蔵において重要な役割を果たす細胞小器官です。それらは、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病などのさまざまな代謝性疾患に関連しています。肝細胞では、LDのサイズと数は脂肪肝疾患の兆候です。さらに、酸化ストレス反応、細胞オートファジー、およびアポトーシスは、LDのサイズと数の変化を伴うことがよくあります。その結果、LDの寸法と量は、LD生合成のメカニズムに関する現在の研究の基礎となっています。ここでは、脂肪酸誘導性ウシ肝細胞において、オイルレッドOを用いてLDを染色する方法と、LDのサイズと数を調べる方法について説明します。LDのサイズ分布を統計的に分析します。小さなLDが大きなLDに融合する過程は、生細胞イメージングシステムによっても観察されます。今回の研究は、異なる生理学的条件下でのLDのサイズ変化傾向を直接観察する方法を提供する。

概要

肝細胞における脂肪滴(LD)の蓄積は、肝線維症および肝細胞癌に進行する可能性のある非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の典型的な特徴です。脂肪肝疾患の最も初期の症状は脂肪症であり、肝細胞の細胞質におけるLD蓄積を特徴とすることが見出^{されている1。}肝脂肪症は、^常にLDの数の増加および/またはサイズの拡大に関連しています2。LDは、中性脂肪(TG)を核とした小胞体(ER)から生成されると考えられており、タンパク質やリン脂質に囲まれています³。TG貯蔵を担う細胞内オルガネラとして、LDは、そのサイズ、数、脂質組成、タンパク質、および他のオルガネラとの相互作用に関して異なる特徴を示し、これらはすべて細胞エネルギー恒常性に影響を与えます⁴。TGレベルはLDのサイズと正の相関があり、細胞内TG含有量が高いほど、より大きなLDを形成する可能性があります⁵。LDは、TGの局所合成、ERへの脂質の取り込み、および^複数のLDの融合によってサイズが増加します6。大きなLDを含む細胞(脂肪細胞、肝細胞など)は、LD融合によって脂質貯蔵を効率的に増加させる特殊なメカニズムを持っています。LDの動的な変化は、細胞のさまざまなエネルギー代謝状態を反映しています。健常細胞と異....

プロトコル

すべての手順は、河南農業大学(中国河南省)の動物管理委員会の倫理基準に従って承認され、実行されました。

1. ウシ肝細胞培養

1. 初代肝細胞^細胞17 を解凍し、400 x g を室温で4分間遠心分離します。
   注:初代肝細胞細胞は、以前に発表されたレポート¹⁷に従って培養および維持されました。
2. 凍結保存液をピペットで廃棄し、10%ウシ胎児血清(FBS)とダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む1 mLの培地で懸濁します。次に、細胞計数チャンバーを使用してミリリットルあたりの細胞数を計算し、上記の細胞懸濁液の濃度を計算し、細胞濃度を1 x 10⁷ 細胞/ mLに調整します。
   1. 上記の培地を3 mL入れた60 mm細胞培養皿に細胞懸濁液を加えます。細胞を培養し、37°Cおよび5%_CO2 で24時間インキュベートします。
3. 細胞が80%まで成長したら、培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、750 μLの0.25%トリプシンを加えて細胞を消化します。細胞を37°Cで3分間インキュベートした後、同量の10%FBSで中和します。細胞懸濁液を回収し、200 x g で室温....

ディスカッション

病理学的状態に応じて、肝LDはその大きさおよび数において途方もない変化を受ける。LDは肝細胞細胞に広く存在し、肝臓の健康と病気に重要な役割を果たします¹⁸。LDの量とサイズは、LDの生合成に関する現在の研究の基礎です¹⁹。細胞および組織のLDのサイズと数は、エネルギーを貯蔵および放出する能力を反映しています。LDの動的変化は、脂質代謝活性.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent