Avaliação do Tamanho e Fusão de Gotículas Lipídicas em Células Hepáticas Bovinas

Resumo

O presente protocolo descreve como usar óleo vermelho O para tingir gotículas lipídicas (DLs), calcular o tamanho e o número de DLs em um modelo de hepatócitos gordurosos induzidos por ácidos graxos e usar BODIPY 493/503 para observar o processo de fusão de pequenas LDs em grandes LDs por imagem de células vivas.

Resumo

As gotículas lipídicas (DLs) são organelas que desempenham um papel importante no metabolismo lipídico e no armazenamento neutro de lipídios nas células. Eles estão associados a uma variedade de doenças metabólicas, como obesidade, doença hepática gordurosa e diabetes. Nas células hepáticas, os tamanhos e o número de DLs são sinais de doença hepática gordurosa. Além disso, a reação de estresse oxidativo, a autofagia celular e a apoptose são frequentemente acompanhadas por mudanças nos tamanhos e números de DLs. Como resultado, as dimensões e a quantidade de DLs são a base da pesquisa atual sobre o mecanismo de biogênese da DL. Aqui, em células hepáticas bovinas induzidas por ácidos graxos, descrevemos como usar o óleo vermelho O para corar LDs e investigar os tamanhos e números de LDs. A distribuição de tamanho dos GDs é analisada estatisticamente. O processo de fusão de pequenos LDs em grandes LDs também é observado por um sistema de imagem de células vivas. O presente trabalho fornece uma maneira de observar diretamente a tendência de mudança de tamanho dos DLs sob diferentes condições fisiológicas.

Introdução

O acúmulo de gotículas lipídicas (DL) nos hepatócitos é a característica típica da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que pode evoluir para fibrose hepática e carcinoma hepatocelular. Verificou-se que a manifestação mais precoce da doença hepática gordurosa é a esteatose, caracterizada pelo acúmulo de DL no citoplasma do hepatócito1. A esteatose hepática está invariavelmente associada ao aumento do número e/ou expansão do tamanho dos^DLs2. Acredita-se que os LDs sejam gerados a partir do retículo endoplasmático (RE), consistindo de triglicerídeos (TG) como núcleo, e são circundados por proteínas e fosfolipídios³. Como organela subcelular responsável pelo armazenamento de TG, os LDs apresentam características diferentes quanto ao tamanho, número, composição lipídica, proteínas e interação com outras organelas, o que afeta a homeostase energética celular⁴. O nível de TG correlaciona-se positivamente com o tamanho dos GDs, e um maior conteúdo intracelular de TG poderia formar maiores DLs⁵. Os LDs aumentam de tamanho através da síntese local de TG, incorporação lipídica no RE e fusão de múltiplos DLs⁶. As células (adipócitos, hepatócitos, etc.) que contêm grandes DLs têm um mecanismo especial para aumentar eficientemente o armazenamento de lipídios por fusão de DL. As mudanças dinâmicas dos LDs refletem os diferentes estados do metabolismo energético da célula. É crucial desenvolver metodologias que permitam a observação e análise das várias DLs hepáticas em células saudáveis e anormais.

Os principais corantes não fluorescentes para LDs são Sudan Black B e oil red O. Sudan Black B cora lipídios neutros, fosfolipídios e esteroides⁷. O óleo vermelho O é usado principalmente para coloração de LDs de músculo esquelético, cardiomiócitos, tecido hepático, células adiposas, etc⁸., sendo considerado uma ferramenta padrão para a detecção quantitativa de esteatose hepática em camundongos e humanos⁹. A mudança dinâmica dos LDs é realizada principalmente pelo tingimento por fluorescência. O vermelho do Nilo e o BODIPY são corantes lipídicos fluorescentes^{comumente utilizados 10,11}. Comparado com o vermelho do Nilo, o BODIPY tem maior permeabilidade tecidual e liga-se melhor aos DLs¹². LDs marcadas com BODIPY podem ser usadas para coloração de células vivas e colocalização com outras organelas¹³.

A incidência de doença hepática gordurosa é significativamente maior em ruminantes do que em monogástricos¹⁴. Durante o período de transição, as vacas leiteiras experimentam um estado de balanço energético negativo³. Grandes quantidades de ácidos graxos não esterificados (ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, etc.) são sintetizados em TGs em hepatócitos bovinos, o que leva a anormalidades funcionais hepáticas e reduz sobremaneira a qualidade dos produtos lácteos e a eficiência produtiva¹⁵. O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para analisar o tamanho e o número de DLs, bem como monitorar a dinâmica de fusão de DL. Construímos um modelo de formação de LD adicionando diferentes concentrações de ácido linoleico (LA) em hepatócitos¹⁶ e observamos as mudanças no tamanho e no número de LDs durante o processo pela coloração de LDs com óleo vermelho O. Além disso, o processo de fusão rápida dos LDs também foi observado pela coloração com BODIPY 493/503.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com os padrões éticos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade Agrícola de Henan (Província de Henan, China).

1. Cultura de células de hepatócitos bovinos

1. Descongelar as células primárias do hepatócito¹⁷ e centrifugar 400 x g por 4 min à temperatura ambiente.
   NOTA: As células primárias dos hepatócitos foram cultivadas e mantidas seguindo um relato previamente publicado¹⁷.
2. Eliminar a solução de armazenamento congelado com pipeta e suspendê-la com 1 mL de meio contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Em seguida, use uma câmara de contagem de células para calcular o número de células por mililitro e, em seguida, calcular a concentração da suspensão celular acima e ajustar a concentração celular para 1 x 10⁷ células/mL.
   1. Adicionar a suspensão celular numa placa de cultura celular de 60 mm contendo 3 ml do meio acima. Cultivar as células e incubá-las a 37 °C e 5% CO₂ por 24 h.
3. Quando as células crescerem até 80%, descarte o meio e enxágue com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 750 μL de tripsina a 0,25% para digerir as células. Incubar as células a 37 °C durante 3 minutos e, em seguida, neutralizá-las com a mesma quantidade de FBS a 10%. Recolher a suspensão celular para centrifugar a 200 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente.

2. Coloração de óleo vermelho O

1. Adicionar 800 μL de meio de cultura contendo 10% de FBS e DMEM em cada poço da placa de cultura celular de 24 poços contendo lamínulas de vidro. Tomar 50 μL da suspensão celular (obtida no passo 1.3) e adicioná-la a 950 μL de PBS para misturar. Use uma câmara de contagem de células para calcular o número de células por mililitro e, em seguida, calcular a concentração da suspensão de células acima. Finalmente, ajustar a concentração celular para 4 x 10⁴/mL em cada poço e incubar a 37 °C e 5% CO₂ por 24 h.
2. Após 24 h, descartar o meio de cultura e lavar com PBS. Suspender com 800 μL de meio de indução DMEM contendo 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA).
3. Dissolver um total de 100 μL de AL (ver Tabela de Materiais) em 900 μL de etanol anidro e preparar uma solução-padrão (100 mmol/L). Adicione um gradiente de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L e 200 μmol/L LA na placa de 24 poços. Repita cada tratamento quatro vezes. Incubar a 37 °C e 5% CO₂ durante 24 h.
4. Retire o meio de cultura e lave as células com PBS três vezes. Fixar com 400 μL de paraformaldeído a 4% por 20 min. Descarte a solução fixadora e lave-a com PBS três vezes.
5. Incubar as células com álcool isopropílico a 60% por 5 min e descartá-las. Adicione a solução de trabalho vermelha O de óleo recém-preparada (consulte a Tabela de Materiais) (proporção 3:2 de óleo vermelho O:água) por 20-30 min e descarte a solução corante. Lave as células com PBS duas a cinco vezes até que não haja excesso de solução de corante.
6. Adicionar 300 μL de solução corante de hematoxilina (relação hematoxilina:água de 1:10) e re-corar o núcleo por 1-2 min. Descarte a solução corante e lave as células com PBS de duas a cinco vezes. Retire as lamínulas de vidro da placa de 24 poços e coloque-as em lâminas microscópicas (o lado com as células viradas para baixo) depois de cair 10 μL de selante de comprimido (ver Tabela de Materiais) na lâmina.
7. Após a selagem, observe e obtenha imagens dos LDs das células sob a lente de óleo do microscópio óptico (ver Tabela de Materiais). Meça o diâmetro dos LDs pelo software cellSens e analise o número e o tamanho dos LDs.

3. Medição do tamanho e número de DLs

1. Capturar imagens: Ligue o interruptor do computador e do microscópio sucessivamente, coloque a lâmina na plataforma de carregamento, abra o software de análise de imagem (consulte Tabela de Materiais) e conecte o computador para visualizar a imagem.
   1. Encontre as imagens em baixa potência e pinge uma quantidade apropriada de óleo de cedro na lâmina de imagem. Ajuste o fator de observação para 100x, defina a exposição automática e capture as imagens ajustando o campo de visão apropriado. Selecione três lâminas de células coradas para cada grupo para geração de imagens.
2. Medição de diâmetro: Selecione aleatoriamente 60 LDs para cada imagem para medir os diâmetros. Após a medição de cada imagem, salve as imagens e envie os resultados da medição em uma tabela para a análise subsequente do tamanho médio e da razão de distribuição dos LDs.
3. Medição de quantidade: Selecione três imagens para cada lâmina corada e fotografada e selecione aleatoriamente três células para medição de quantidade em cada imagem. Conte e analise o número de LDs ao redor da célula e calcule o número médio de LDs na célula.

4. Observação dinâmica da fusão de DL

1. Siga as etapas de cultura de células conforme mencionado nas etapas 1.1-1.3. Quando as células crescerem até 80%, descarte o meio e enxágue com PBS, depois digeri-las com 750 μL de tripsina por 3 min. Em seguida, adicionar 750 μL do meio, centrifugar a 200 x g por 4 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
2. Suspender as células em 1 mL de meio de cultura, contar e ajustar a concentração celular para 5 x 10⁵ células/mL em uma placa de 35 mm. Cultura a 37 °C e 5% CO₂ por 24 h.
3. Quando as células tiverem crescido até 80%, trocar o meio para DMEM + 150 μmol/L LA por 24 h e continuar a cultura em estufa a 37 °C e 5% CO₂ para acumular os LDs.
4. Após 24 h, retirar o meio de cultura. Lavar as células aderentes com PBS e incubá-las com sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 de 10 μg/mL (ver Tabela de Materiais) no escuro por 30 min. Após a incubação, lavar as células na placa de cultura com PBS três vezes e adicionar DMEM + 150 μmol/L LA.
   NOTA: Evitar exposição à luz durante e após a coloração de 10 μg/mL de BODIPY; 1 mg/mL de BODIPY foi diluído com PBS (1:100).
5. Coloque a placa de cultura no sulco do microscópio da estação de células vivas (ver Tabela de Materiais) para observar as mudanças dinâmicas dos LDs. Ligue a energia da estação de trabalho de células vivas de acordo com a sequência de partida e evite a luz.
   1. Ligue a energia, a fonte de luz de transmissão, a fonte de alimentação do microscópio, a fonte de luz fluorescente da lâmpada de mercúrio, a fonte de alimentação da câmera do dispositivo acoplado à carga (CCD), a fonte de alimentação do host do computador, a válvula de CO 2 e a incubadora de CO₂.
6. Adicione água destilada ao sulco da plataforma de carga, garantindo que não ultrapasse a saída de ar.
7. Ligue o computador e execute "NIS-Elements". Primeiro, encontre o campo de visão apropriado na lente objetiva 4x e, em seguida, ajuste-o para a lente objetiva 40x sucessivamente. Selecione E100 para observar a amostra no microscópio e L100 para visualizar e fotografar a amostra no computador.
   NOTA: E100 e L100 são botões de ajuste do microscópio na estação de trabalho da célula viva (ver Tabela de Materiais), representando a ocular e a tela do computador, respectivamente.
8. Projete os parâmetros como canal de fluorescência (por exemplo, Ph-40x, isotiocianato de fluoresceína [FITC], obturador) e tempo de filmagem esperado para o experimento. Defina o tempo de filmagem no tempo, incluindo o tempo de intervalo de disparo de 5 min entre cada duas imagens e um tempo total de filmagem de 6 h.
   NOTA: A filmagem de longa duração precisa usar a função de estabilização de foco do sistema de foco perfeito (PFS). Para isso, primeiro ajuste o campo de visão e o comprimento do foco, depois clique em PFS na tela do computador e, finalmente, ajuste a espiral de foco fino.
9. Selecione diferentes modos de canal, canal único ou todos, selecione um campo de visão diferente, clique em visualizar, ajuste o campo de visão, defina esses parâmetros e clique em iniciar execução para começar a filmar. Faça um teste por 5 minutos primeiro; Pode levar muito tempo depois que a operação é normal.
10. Depois que a gravação for executada, escolha Arquivo > Salvar como > Salvar tipo > formato avi para exportar os dados para um vídeo no formato 'avi'. Use o formato de imagem '.nd2' para salvar o programa de dados e exportar as fotos.
11. Para desligar a máquina, desligue-a na ordem inversa.

5. Estatística e análise dos resultados

1. Analise os dados usando ANOVA unidirecional. Relate os resultados como média ± erro padrão.

Resultados

A coloração dos LDs celulares é mostrada na Figura 1. Os pontos vermelhos refletem os LDs das células, e os pontos azuis refletem os núcleos. Pode-se observar que o tamanho e o número de DLs em cada quadro são diferentes no tratamento do AL.

Com o aumento da dosagem de AL, o diâmetro médio e o número de DLs apresentaram tendência de aumento significativo, dependendo da concentração de AE (Figura 2). Como mostrado na

Discussão

Dependendo dos estados patológicos, os LDs hepáticos sofrem tremendas mudanças em seu tamanho e número. Os DLs estão amplamente presentes nas células dos hepatócitos e desempenham um papel fundamental na saúde e doença^hepática18. A quantidade e o tamanho dos DLs são a base da pesquisa atual sobre a biogênese dos DLs¹⁹. O tamanho e o número de LDs para células e tecidos refletem sua capacidade de armazenar e liberar energia. As alterações dinâmicas dos GDs m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent