Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ترتبط مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بأمراض مختلفة ، وغالبا ما يستخدم التألق المناعي لتصورها. ومع ذلك ، هناك العديد من بروتوكولات التلوين ، وفي كثير من الحالات ، يتم فحص نوع واحد فقط من الأنسجة. هنا ، نضع بروتوكولا قابلا للتطبيق بشكل عام لتلطيخ الشبكات في الفئران والأنسجة البشرية.

Abstract

يتم إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بواسطة العدلات كاستجابة للعدوى البكتيرية أو تلف الأنسجة الرضحية ولكنها تلعب أيضا دورا في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات المعقمة. إنها هياكل تشبه الويب تتكون من خيوط الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، والهستونات ، والبروتينات المضادة للميكروبات. بمجرد إطلاقها ، يمكن للشبكات أن تحبس وتقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة. علاوة على ذلك ، تشارك الشبكات في تنظيم الاستتباب عن طريق تحفيز التصاق الصفائح الدموية وتجلطها. ومع ذلك ، فقد ارتبط الإنتاج غير المنظم للشبكات أيضا بأمراض مختلفة ، بما في ذلك الإنتان أو اضطرابات المناعة الذاتية ، مما يجعلها هدفا واعدا للتدخل العلاجي. بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، يعد تصور الشبكات باستخدام التصوير المناعي حاليا أحد الطرق الوحيدة المعروفة لإظهار تفاعلات NET في الأنسجة. لذلك ، تم استخدام طرق تلطيخ مختلفة لتصور NETs. في الأدبيات ، تم وصف بروتوكولات تلطيخ مختلفة ، وحددنا أربعة مكونات رئيسية تظهر تباينا كبيرا بين البروتوكولات: (1) أنواع الأجسام المضادة المستخدمة ، (2) استخدام عوامل تقليل التألق الذاتي ، (3) طرق استرجاع المستضد ، و (4) النفاذية. لذلك ، تم تكييف بروتوكولات التلوين المناعي في المختبر وتحسينها بشكل منهجي في هذا العمل لجعلها قابلة للتطبيق على الأنواع المختلفة (الفأر ، الإنسان) والأنسجة (الجلد والأمعاء والرئة والكبد والقلب والقرص الفقري). بعد التثبيت وتضمين البارافين ، تم تركيب أقسام بسمك 3 ميكرومتر على شرائح. تم تلطيخ هذه العينات بالأجسام المضادة الأولية ل myeloperoxidase (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، وإيلاستاز العدلات (NE) وفقا لبروتوكول تلطيخ معدل. تم تلطيخ الشرائح بأجسام مضادة ثانوية وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحليل النتائج وفقا لورقة تقييم ، وتم تسجيل الاختلافات شبه الكمية.

هنا ، نقدم بروتوكول تلطيخ صافي محسن مناسب للأنسجة المختلفة. استخدمنا جسما مضادا أوليا جديدا لتلطيخ H3cit وقللنا من تلطيخ غير محدد بعامل تقليل التألق الذاتي. علاوة على ذلك ، أثبتنا أن التلوين الصافي يتطلب درجة حرارة عالية ثابتة ومعالجة دقيقة للعينات.

Introduction

تم تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) لأول مرة بواسطة Brinkmann et al. كمسار للموت الخلوي يختلف عن موت الخلايا المبرمج والنخر في عام 20041. في هذا المسار ، تطلق العدلات الكروماتين غير المكثف في الفضاء خارج الخلية لتشكيل هياكل كبيرة تشبه الويب مغطاة بالبروتينات المضادة للميكروبات التي كانت مخزنة سابقا في الحبيبات أو العصارة الخلوية. تشمل هذه البروتينات المضادة للميكروبات إيلاستاز العدلات (NE) ، والميلوبيروكسيديز (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، والتي تستخدم عادة للكشف المناعي غير المباشر عن NETs2. هذه الطريقة لا تحدد فقط الوجود الكمي لهذه البروتينات. في الواقع ، لديها ميزة الكشف على وجه التحديد عن الهياكل الشبيهة بالشبكة. في الشبكات ، تتركز البروتينات المذكورة مع الحمض النووي خارج الخلية ، والذي يمكن اكتشافه من خلال تداخل الإشارات الفلورية لكل بروتين ملطخ والحمض النووي خارج الخلية. على عكس الإشارات المتداخلة بسبب الحمض النووي خارج الخلية والتوطين المشترك للبروتين في الشبكات ، لا تظهر العدلات السليمة أي توطين مشترك. هنا ، عادة ما يتم تخزين مكونات NET بشكل منفصل في الحبيبات والنوى والسيتوسول3.

منذ اكتشافها لأول مرة ، ثبت أن الشبكات تلعب دورا مركزيا في العديد من الأمراض ، لا سيما تلك التي تنطوي على التهاب. تظهر الشبكات وظائف مضادة للميكروبات أثناء العدوى من خلال محاصرة وقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة 4,5. ومع ذلك ، فقد تم ربط الشبكات أيضا بأمراض المناعة الذاتية والاستجابات المفرطة الالتهاب ، مثل الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتيزمي والربو التحسسي6،7،8. تعزز الشبكات انسداد الأوعية والالتهابات في تصلب الشرايين ، والتصاق الصفائح الدموية ، ومن المتوقع أن تلعب دورا في السرطانالنقيلي 9،10،11. ومع ذلك ، يعتقد أن لها خصائص مضادة للالتهابات عن طريق تقليل مستويات السيتوكين المسببة للالتهابات12. بينما تكتسب الشبكات اهتماما أكبر بمجال أوسع من البحث ، فإن طريقة الكشف عن NET القوية أمر أساسي للبحث في المستقبل.

على الرغم من أن تصور الشبكات في الأنسجة المختلفة باستخدام التصوير المناعي معقد ويتطلب التخصيص ، بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، إلا أنه يعد حاليا أحد أشهر الطرق لتصور التفاعلات بين الشبكات والخلايا ويستخدم في الغالب في الأنسجة المدمجة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE)13,14. ومع ذلك ، فإن مقارنة التصوير NET أمر صعب ، حيث تستخدم المختبرات المختلفة بروتوكولاتها المخصصة. تختلف هذه البروتوكولات في استخدامها للأجسام المضادة أو استرجاع المستضد أو طريقة النفاذية وغالبا ما يتم تحسينها لنوع معين من الأنسجة3،13،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26، 27.

بعد أن نشر Brinkmann et al. أول دراسة منهجية باستخدام التصور المناعي الفلوري للشبكات في أنسجة FFPE ، أردنا تحسين هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من الأنسجة والأنواع15. بالإضافة إلى ذلك ، لإنشاء بروتوكول تألق مناعي قابل للتطبيق على نطاق واسع ، اختبرنا بروتوكولات معدلة مختلفة من الدراسات التي استخدمت طرق التألق المناعي في أنسجة FFPE للكشف عن الشبكات3،13،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25 ، 26,27. علاوة على ذلك ، جربنا جسما مضادا جديدا ل H3cit لتلطيخ أكثر تحديداخارج الخلية 28. نحن نفترض أنه من خلال تكييف بروتوكولات التلوين الحالية بشكل منهجي مع الأنواع والأنسجة المختلفة ، يمكن تحسين التصوير في المختبر ، مما يؤدي إلى تمثيل أفضل للتفاعل بين العدلات والشبكات محليا ومنهجيا.

Protocol

شملت هذه الدراسة أنسجة الفئران المشتقة من التجارب المعتمدة من قبل إدارة ولاية هامبورغ للبحوث الحيوانية ، Behörde für Justiz und Verbraucherschutz ، هامبورغ ، ألمانيا (73/17 ، 100/17 ، 94/16 ، 109/2018 ، 63/16). كانت الأنسجة المستخدمة هي رئة الفأر والقولون من نموذج الصرف الصحي والجلد المحترق. استخدمنا الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اتباع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية لجميع التجارب. تضمنت العينات البشرية مجهولة المصدر أنسجة من التهاب الأمعاء والقولون الوليدي ، والجلد المحروق ، ورتق القناة الصفراوية ، والتهاب الفقار ، وعضلة القلب. وفقا للجنة أخلاقيات البحوث الطبية في هامبورغ ، لم تكن العينات بحاجة إلى موافقة مستنيرة ، ولكن تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة (WF-026/21).

1. تثبيت العينة

  1. استخدم البروتوكول التالي المشتق من أبو عابد وبرينكمان لتثبيت العينات ، والجفاف ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتركيب3،15.
    1. تحضير محلول الفورمالديهايد 4٪ عن طريق إذابة 40 جم من بارافورمالدهايد (PFA) في 800 مل من محلول ملحي مخزن Tris ، درجة الحموضة 7.4 (TBS).
    2. يقلب المزيج على حرارة 60 درجة مئوية تحت غطاء دخان حتى يذوب PFA. أحضر المحلول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، واضبط مستوى الصوت باستخدام TBS إلى 1000 مل.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. يخزن في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. لتثبيت العينة، ضع الأنسجة الطازجة في محلول TBS، وقم بتشليلها إلى قطع أصغر من 20 مم × 30 مم × 3 مم. اغمر أقسام الأنسجة في محلول بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 12-24 ساعة.
    ملاحظة: استخدم البروتوكول الأصلي محلول PFA بنسبة 2٪ ووقت تثبيت من 8-20 ساعة. مع هذه الطريقة ، لم يتم تثبيت بعض أقسام الأنسجة بالكامل بعد 20 ساعة ، لذلك تم زيادة تركيز PFA إلى 4٪ PFA.
  3. نقل العينات إلى أشرطة معالجة الأنسجة الملصقة. استخدم أقلام تحديد أو أقلام رصاص مقاومة للمذيبات لوضع العلامات.
  4. ابدأ تجفيف العينة عن طريق غمر الكاسيت في 70٪ إيثانول لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، انغمس في 80٪ إيثانول ، و 90٪ إيثانول ، و 96٪ إيثانول ، ومرتين في 100٪ إيثانول ، مع كل خطوة تدوم 1 ساعة.
  5. اغمر مرتين في 100٪ زيلين (ثنائي ميثيل بنزين) ثم مرتين في 60 درجة مئوية من البارافين لمدة 1 ساعة في كل مرة.
  6. استخدم قوالب التضمين للتركيب ، واترك البارافين يتجمد قبل إزالة القالب.
  7. استخدم ميكروتوم لقطع أقسام الأنسجة السميكة 3 ميكرومتر.
  8. استخدم الملقط لوضع الأجزاء المقطوعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، واتركها تطفو على السطح لتمديد جروح الأنسجة.
  9. ضع الأقسام على شرائح زجاجية لاصقة (جدول المواد) ، واتركها تجف طوال الليل في غرفة حرارة 40 درجة مئوية.

2. عينة الإماهة

  1. لإزالة البارافين ، قم بتكديس الشرائح في رف منزلق ، واغمرها مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في الليمونين المتوسط البديل للزيلين (جدول المواد) ومرة واحدة لمدة 5 دقائق في خليط 1: 1 ليمونين / إيثانول.
    تنبيه: الليمونين قابل للاشتعال عند 50 درجة مئوية ويمكن أن يسبب الحساسية. استخدميه تحت غطاء الدخان مع حماية العين والقفازات. الابتعاد عن إطلاق النار.
  2. أعد ترطيب العينات في سلسلة إيثانول تنازلية عن طريق غمر الرف المنزلق مرتين في إيثانول 100٪ ومرة واحدة في 96٪ إيثانول و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول و 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في ماء منزوع الأيونات (ماء DI) لتنظيف أي إيثانول متبقي.

3. حجب التألق الذاتي واسترجاع المستضد

  1. قم بإعداد محلول استرجاع الهدف pH 6 citrate (TRS) (جدول المواد) وفقا لورقة البيانات. يتركز هذا TRS 10 مرات. لذلك ، تمييع 1:10 بالماء DI. سخني في برطمان بلاستيكي إلى 96 درجة مئوية.
    ملاحظة: يكسر TRS جسور الميثيلين التي تشكلت أثناء تثبيت العينة لكشف حوامل المستضد. وهذا يسمح للأجسام المضادة الأولية بربط مولد الضد المستهدف. يخزن TRS المركز في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة 8 أشهر. قم دائما بإعداد TRS الطازجة.
  2. أخرج الشرائح من رف الشرائح ، وضعها في غرفة مبللة. ماصة قطرة إلى قطرتين من عامل تقليل التألق الذاتي (جدول المواد) على كل عينة. احتضان لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يمنع عامل الحد من التألق الذاتي التألق الذاتي للأنسجة المتأصلة الناجم عن الفلوروفورات الداخلية والمثبتات. قم بتخزين عامل تقليل التألق الذاتي في RT لمدة تصل إلى 1 سنة.
    ملاحظة: العمل فقط مع أقسام صغيرة من الأنسجة لتجنب جفاف العينات أو تجاوز وقت الحضانة.
  3. قم بتكديس الشرائح مرة أخرى في رف الشرائح ، واشطفها لمدة 1 دقيقة في 60٪ من الإيثانول باستخدام حركة تصاعدية وهبوطية حتى يتم غسل كل كاشف تقليل التألق الذاتي غير المستخدم.
  4. اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في ماء DI.
  5. لاسترجاع المستضد ، انقل الشرائح إلى جرة تلطيخ باستخدام TRS المسخن مسبقا. احتضان لمدة 10 دقائق على 96 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: يمكن استبدال حمام الماء 96 درجة مئوية بميكروويف أو طباخ بخار إذا تم تسخين TRS مسبقا إلى 96 درجة مئوية وتم ضمان 10 دقائق من وقت الحضانة عند 96 درجة مئوية.
  6. أخرج برطمان التلوين واتركه يبرد ببطء إلى RT لمدة 60-90 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة تصل إلى 4 ساعات ، مع ترك الشرائح في TRS.
  7. قم بإزالة TRS ، ولكن احتفظ بالشرائح في الجرة. اشطفيه مرتين بمحلول ملحي مخزن من Tris مع 0.05٪ توين (TBST ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 دقائق لكل منهما لغسل أي بقايا TRS متبقية.
  8. للنفاذية ، قم بإعداد 0.2٪ Triton في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، واملأه في جرة التلوين لنفاذ العينات لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يعزز النفاذية ارتباط الأجسام المضادة الأولية بالبروتينات المستهدفة داخل الخلايا في العينات الثابتة.
  9. شطف الشرائح مرة أخرى مرتين في TBST لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  10. تحضير الغرفة الرطبة ، ووضع الشرائح. امسح الماء الزائد من الشرائح بمناديل ورقية. ضع دائرة حول كل عينة باستخدام قلم حاجز كاره للماء لمنع محلول الجسم المضاد من الجريان.
    ملاحظة: لا تدع العينات تجف. من الأفضل العمل مع أقسام صغيرة.

4. منع ربط الأجسام المضادة غير المحددة

  1. خذ محلول مانع جاهز للاستخدام مع مصل الحمير (جدول المواد) ، وماصة قطرة واحدة على كل عينة. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    ملاحظة: تقلل خطوة الحظر هذه من ارتباط الجسم المضاد الثانوي بمواقع ربط غير محددة على العينة. بعد منع هذه الحواتم غير المتخصصة وتطبيق الجسم المضاد الأولي ، سيرتبط الجسم المضاد الثانوي بالجسم المضاد الأولي ولن يتفاعل مع سطح النسيج. يتم تخزين كاشف الحجب الجاهز للاستخدام في 2-8 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  2. قم بإزالة محلول الحظر الزائد من الشرائح عن طريق النقر على حافة الشرائح على سطح صلب. لا تشطفها.

5. الأجسام المضادة الأولية

  1. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد). استخدم ما يقرب من 100 ميكرولتر من المحلول النهائي لكل عينة. بالنسبة للجسم المضاد NE و H3cit (R8) والتحكم في الأيزوكونترول ، قم بتخفيفه إلى تركيز 5 ميكروغرام / مل. بالنسبة ل MPO والتحكم في الأيزوكونترول المقابل ، استخدم 10 ميكروغرام / مل. قم بإعداد أنبوب واحد لكل جسم مضاد أولي وأنبوب واحد لكل جسم مضاد متساوي التحكم.
    ملاحظة: يمكن دمج H3cit (R8) / MPO أو NE / MPO وعناصر التحكم الخاصة بهم لتلطيخ NETs. بالنسبة لمزيج H3cit (R8) / MPO ، خفف إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل ل H3cit (R8) و 10 ميكروغرام / مل ل MPO إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى NE / MPO ، خفف إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل ل NE و 10 ميكروغرام / مل ل MPO إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى isocontrol ، استخدم نفس التركيز لكل جسم مضاد مقابل. استخدم دائما طرف ماصة جديدا لكل جسم مضاد مستخدم. يمكن تخزين الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع وعند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.
  2. مع عينتين على شريحة واحدة ، استخدم واحدة للأجسام المضادة isocontrol والأخرى لتخفيف الأجسام المضادة MPO / H3cit أو MPO / NE. استخدم ما يقرب من 100 ميكرولتر لكل عينة ، وانشر محلول الأجسام المضادة بالتساوي.
    ملاحظة: لا تدع العينات تجف. كن حذرا لتجنب الخلط بين الأجسام المضادة المتساوية والأجسام المضادة الأولية.
  3. يحفظ في حجرة مبللة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. في اليوم التالي ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة من الشرائح ، وقم بتكديس الشرائح في كوفيت. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع TBST لغسل محلول الأجسام المضادة الأولية المتبقية.

6. الأجسام المضادة الثانوية

  1. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية. استخدم اثنين من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المختلفة: حمار مضاد للماعز ل MPO ومضاد للأرانب للحمار لتلطيخ H3cit. قم بتخفيف كل واحد إلى تركيز 7.5 ميكروغرام / مل باستخدام محلول تخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد).
    ملاحظة: للتلطيخ المزدوج ، استخدم جسمين مضادين فلوريين بمناطق إثارة مختلفة والحد الأدنى من التداخل الطيفي. الجمع بين كل من الأجسام المضادة الثانوية ، وتخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 7.5 ميكروغرام / مل لكل جسم مضاد لحجم نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة. حماية الأجسام المضادة من الضوء. يمكن تخزين الأجسام المضادة الثانوية في 2-8 درجة مئوية لمدة 6-8 أسابيع أو في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. احتفظ بالشرائح في الحجرة الرطبة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل عينة. دعهم يحتضنون لمدة 30 دقيقة في RT ومحميين من الضوء.
  3. اضغط على محلول الأجسام المضادة الثانوية الزائدة ، وقم بتكديس الشرائح في رف الشرائح. اغمر ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في جرة ملطخة مملوءة ب PBS لغسل أي أجسام مضادة غير مقيدة متبقية.
  4. تحضير محلول DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) (جدول المواد) ، وتخفيفه إلى تركيز 1 ميكروغرام / مل مع ماء DI. اغمر الرف المنزلق في جرة تلطيخ بمحلول DAPI ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
    ملاحظة: يستخدم DAPI كصبغة فلورية للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. يمكن استخدام حل DAPI المحضر عدة مرات. قم بتخزين حل DAPI المعد في RT. يمكن تخزين مركز DAPI في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  5. اغمر الرف المنزلق لمدة 5 دقائق في وعاء تلطيخ باستخدام برنامج تلفزيوني لغسل محلول DAPI الزائد.

7. تركيب وتخزين العينات والتحليل المجهري

  1. قم بتركيب العينات باستخدام أغطية ووسط تركيب (جدول المواد).
    ملاحظة: استخدم كميات صغيرة فقط من وسيط التركيب ، وامسح الوسط الزائد بمناديل مبللة. ارتد القفازات ، وتجنب مسح أي وسيط عن طريق الخطأ من أغطية الغطاء أو الشرائح. تجنب تكوين الفقاعات ، واستخدم مسحات القطن للضغط برفق على أغطية الغطاء لإزالة أي فقاعات من الشرائح.
  2. للتصوير ، استخدم مجهرا واسع المجال أو مجهرا متحد البؤر.
    ملاحظة: التقط صورة لعنصر التحكم المتماثل أولا. قم بتقليل وقت التعرض لمرشحات التألق (باستثناء المرشح الأزرق ل DAPI) حتى لا يمكن اكتشاف أي إشارة تقريبا. ثم استخدم هذا الإعداد لفحص العينات المقابلة. ابحث عن المناطق التي يمكن فيها اكتشاف إشارة الفلورسنت في كل عينة فردية باستخدام قناة التألق. بعد التقاط صورة للمنطقة ، يقوم البرنامج بإنشاء صورة مركبة لجميع القنوات ويظهر إشارات مضان مختلفة كتداخل بألوان مختلفة. يمكن بعد ذلك تحليل الصورة بشكل أكبر للتوطين المشترك مع برامج التصوير مثل ImageJ.
  3. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

النتائج

قبل البدء في تحسين البروتوكول الخاص بنا ، حددنا الخطوات الرئيسية للتلوين الناجح من خلال البحث في PubMed عن الدراسات التي استخدمت أنسجة FFPE للتلطيخ المناعي للشبكات وقارنا بروتوكولاتها. تم تحديد الاختلافات الواعدة في البروتوكول كخطوات رئيسية لتحسين البروتوكول ، في حين لم يتم تغيير الخطوات ال?...

Discussion

في هذا العمل ، كنا نهدف إلى تكييف وتحسين البروتوكولات الحالية لتصوير الشبكات لمزيد من أنواع الأنسجة ، بدءا من عملية التلوين الفعلية. الخطوة الأولى الحاسمة لهذه الطريقة هي اختيار الأجسام المضادة الأكثر ملاءمة. بالنسبة إلى NE ، جربنا جسما مضادا NE من مضيف فأر على الأنسجة البشرية ، والذي لم يظ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تأسست هذه الأبحاث من قبل جمعية الأبحاث الألمانية (BO5534). نشكر أنطونيا كيويت وموريتز لينز ويوهانا هاجنز والدكتورة أنيكا هوير والأستاذة العامة الدكتورة إنغو كونيغس على تزويدنا بالعينات. بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون فريق مرفق التصوير المجهري UKE (المرفق الأساسي ، كلية الطب UKE) على الدعم في الفحص المجهري المناعي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
      Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µgabcamAb 68672 1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µgabcamAb 51031:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µgabcamAb 259891:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µgabcamAb 908101:50
Axiovision Microscopy Software Zeiss4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50mlGeneTex GTX30972
CoverslipsMarienfeld0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS antibody dilution 500 mLDCS diagnosticsDCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Donkey anti rabbit AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Donkey anti rabbit Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G Mounting MediumInvitrogen00-4958-02
Glass slide rackRothH552.1
Human/Mouse MPO AntibodyR&D SystemsAF 3667 1:20
Hydrophobic PenKISKERMKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mgabcamAb 374151:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
Microscopy cameraZeissAxioCamHR3
MicrowaveBoschHMT84M421
Mouse IgG1 negative controlDakoX0931 Aglient1:50 and 1:5
Normal Goat IgG ControlR&D SystemsAB-108-C 1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP staining jarRoth2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µgabcamAb 2194061:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µgabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth 6640
SuperFrost Plus slidesR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
Water bathMemmert830476
Water bath rice cookerreishungerRCP-30
Wet chamberWeckert Labortechnik600016
Zeiss Widefield microscopeZeissAxiovert 200M

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved