İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyona veya travmatik doku hasarına yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır, ancak aynı zamanda otoimmün hastalıklarda ve steril inflamasyonda da rol oynar. Çift sarmallı DNA filamentleri, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. Serbest bırakıldıktan sonra, NET'ler kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayabilir ve öldürebilir. Ayrıca, NET'ler trombosit adezyonunu ve pıhtılaşmayı uyararak homeostatik regülasyona katılırlar. Bununla birlikte, NET'lerin düzensiz üretimi, sepsis veya otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir ve bu da onları terapötik müdahale için umut verici bir hedef haline getirmektedir. Elektron mikroskobunun yanı sıra, immünofloresan görüntüleme kullanılarak NET'lerin görüntülenmesi, şu anda dokudaki NET etkileşimlerini göstermek için bilinen tek yöntemlerden biridir. Bu nedenle, NET'leri görselleştirmek için çeşitli boyama yöntemleri kullanılmıştır. Literatürde farklı boyama protokolleri tanımlanmış ve protokoller arasında yüksek değişkenlik gösteren dört anahtar bileşen tanımlanmıştır: (1) kullanılan antikor tipleri, (2) otofloresan azaltıcı ajanların kullanımı, (3) antijen elde etme yöntemleri ve (4) geçirgenlik. Bu nedenle, in vitro immünofloresan boyama protokolleri, farklı türler (fare, insan) ve dokular (cilt, bağırsak, akciğer, karaciğer, kalp, omurilik) için uygulanabilir hale getirmek için bu çalışmada sistematik olarak uyarlanmış ve geliştirilmiştir. Fiksasyon ve parafin gömüldükten sonra 3 μm kalınlığındaki kesitler slaytlara monte edildi. Bu örnekler, modifiye bir boyama protokolüne göre miyeloperoksidaz (MPO), sitrüline histon H3 (H3cit) ve nötrofil elastaz (NE) için birincil antikorlarla boyandı. Slaytlar sekonder antikorlarla boyandı ve geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Sonuçlar bir değerlendirme formuna göre analiz edildi ve farklılıklar yarı nicel olarak kaydedildi.

Burada, farklı dokular için uygun optimize edilmiş bir NET boyama protokolü sunuyoruz. H3cit için boyama yapmak için yeni bir primer antikor kullandık ve otofloresan indirgeyici bir ajan ile spesifik olmayan boyamayı azalttık. Ayrıca, NET boyamanın sabit bir yüksek sıcaklık ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirdiğini gösterdik.

Giriş

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) ilk olarak Brinkmann ve ark. 2004^yılında apoptoz ve nekrozdan farklı bir hücresel ölüm yolu olarak 1. Bu yolda, nötrofiller, daha önce granüllerde veya sitozolde depolanan antimikrobiyal proteinlerle kaplı büyük ağ benzeri yapılar oluşturmak için yoğunlaştırılmış kromatinlerini hücre dışı boşluğa bırakırlar. Bu antimikrobiyal proteinler, NET'lerin dolaylı immünofloresan tespiti için yaygın olarak kullanılan nötrofil elastaz (NE), miyeloperoksidaz (MPO) ve sitrüline histon H3'ü (H3cit) içerir². Bu yöntem sadece bu proteinlerin kantitatif varlığını tanımlamakla kalmaz; gerçekten de, NET benzeri yapıları özel olarak tespit etme avantajına sahiptir. NET'lerde, söz konusu proteinler, her bir boyanmış proteinin ve hücre dışı DNA'nın floresan sinyallerinin üst üste binmesiyle tespit edilebilen hücre dışı DNA ile birlikte lokalize olur. NET'lerde hücre dışı DNA ve protein kolokalizasyonuna bağlı örtüşen sinyallerin aksine, sağlam nötrofiller kolokalizasyon göstermez. Burada, NET bileşenleri genellikle granüllerde, çekirdeklerde ve sitozol^3'te ayrı olarak depolanır.

İlk keşflerinden bu yana, NET'lerin başta inflamasyon olmak üzere birçok hastalıkta merkezi bir rol oynadığı gösterilmiştir. NET'ler, kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayıp öldürerek enfeksiyon sırasında antimikrobiyal işlevler gösterir ^4,5. Bununla birlikte, NET'ler sistemik lupus eritematozus, romatizmal artrit ve alerjik astım gibi otoimmün hastalıklar ve hiperinflamatuar yanıtlarla da bağlantılıdır ^6,7,8. NET'ler aterosklerozda, trombosit yapışmasında vazo-oklüzyon ve inflamasyonu teşvik eder ve metastatik kanserde rol oynadığı tahmin edilmektedir 9,10,11. Bununla birlikte, proinflamatuar sitokin düzeylerini azaltarak anti-inflamatuar özelliklere sahip oldukları düşünülmektedir¹². NET'ler daha geniş bir araştırma alanına daha fazla ilgi gösterse de, gelecekteki araştırmalar için sağlam bir NET algılama yöntemi esastır.

İmmünofloresan görüntüleme kullanılarak farklı dokulardaki NET'lerin görüntülenmesi karmaşık ve özelleştirme gerektirse de, elektron mikroskobu dışında, şu anda NET'ler ve hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için en bilinen yöntemlerden biridir ve ağırlıklı olarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda (FFPE) ^{kullanılmaktadır13,14}. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar kendi özelleştirilmiş protokollerini kullandığından, NET görüntülemeyi karşılaştırmak zordur. Bu protokoller antikor, antijen alımı veya geçirgenlik yöntemi kullanımlarında farklılık gösterir ve genellikle belirli bir doku tipi için optimize edilmiştir 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Brinkmann ve ark. FFPE dokusunda NET'lerin immünofloresan görselleştirmesini kullanan ilk metodik çalışmayı yayınladıktan sonra, bu protokolü daha geniş bir doku ve tür çeşitliliği için optimize etmek istedik¹⁵. Ek olarak, geniş çapta uygulanabilir bir immünofloresan protokolü oluşturmak için, NET'leri tespit etmek için FFPE dokusunda immünofloresan yöntemlerini kullanan çalışmalardan farklı modifiye protokolleri test ettik 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Ayrıca, daha spesifik hücre dışı boyama için yeni bir H3cit antikoru denedik²⁸. Mevcut boyama protokollerini farklı türlere ve dokulara sistematik olarak uyarlayarak, in vitro görüntülemenin geliştirilebileceğini ve bunun sonucunda nötrofiller ve NET'ler arasındaki etkileşimin hem lokal hem de sistemik olarak daha iyi temsil edilebileceğini varsayıyoruz.

Protokol

Bu çalışma, Hamburg Eyalet Hayvan Araştırmaları İdaresi, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Almanya (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16) tarafından onaylanan deneylerden elde edilen fare dokularını içermektedir. Kullanılan dokular septik bir modelden fare akciğeri ve kolon ve yanmış deriydi. 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullandık. Tüm deneyler için bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uyulmuştur. Anonimleştirilmiş insan örnekleri, yenidoğan enterokolit, yanmış cilt, biliyer atrezi, spondilodiskit ve miyokard dokularını içeriyordu. Hamburg Tıbbi Araştırma Etik Kurulu'na göre, numunelerin bilgilendirilmiş onam almasına gerek yoktu, ancak çalışma komite tarafından onaylandı (WF-026/21).

1. Örnek fiksasyon

1. Numune fiksasyonu, dehidrasyon, parafin gömme, kesit alma ve montaj için Abu Abed ve Brinkmann'dan türetilen aşağıdaki protokolü kullanın ^3,15.
   1. 40 g paraformaldehiti (PFA) 800 mL Tris tamponlu salin, pH 7.4 (TBS) içinde çözerek% 4 formaldehit çözeltisi hazırlayın.
   2. Karışımı 60 °C'de çeker ocak altında PFA eriyene kadar karıştırın. Çözeltiyi oda sıcaklığına (RT) getirin ve TBS ile ses seviyesini 1.000 mL'ye ayarlayın.
   3. PH'ı 7.4'e ayarlayın. 4 °C'de 2-3 hafta veya -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
2. Numune fiksasyonu için, taze dokuyu TBS tamponuna yerleştirin ve 20 mm x 30 mm x 3 mm'den daha küçük parçalara ayırın. Doku bölümlerini 12-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
   NOT: Orijinal protokol %2'lik bir PFA çözeltisi ve 8-20 saatlik bir sabitleme süresi kullandı. Bu yöntemle bazı doku kesitleri 20 saat sonra tam olarak fikse edilmediği için PFA konsantrasyonu %4 PFA'ya çıkarıldı.
3. Numuneleri etiketli doku işleme kasetlerine aktarın. Etiketleme için solvente dayanıklı işaretleyiciler veya kurşun kalemler kullanın.
4. Kasetleri 1 saat boyunca %70 etanole batırarak numune dehidrasyonunu başlatın. Ardından, her adım 1 saat sürecek şekilde %80 etanol, %90 etanol, %96 etanol ve iki kez %100 etanole daldırın.
5. Her seferinde 1 saat boyunca iki kez %100 ksilene (dimetilbenzen) ve ardından iki kez 60 °C parafine daldırın.
6. Montaj için gömme kalıpları kullanın ve kalıbı çıkarmadan önce parafinin katılaşmasına izin verin.
7. 3 μm kalınlığındaki doku kesitlerini kesmek için bir mikrotom kullanın.
8. Kesilen bölümleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirmek için cımbız kullanın ve doku kesiklerini germek için yüzeyde yüzmelerine izin verin.
9. Bölümleri yapışkan cam slaytlara (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve gece boyunca 40 °C'lik bir ısı odasında kurumaya bırakın.

2. Örnek rehidrasyon

1. Deparafinizasyon için, slaytları bir slayt rafına istifleyin ve her biri 5 dakika boyunca ksilen ikame ortamı limonene (Malzeme Tablosu) iki kez ve bir kez 5: 1 limonen / etanol karışımına 1 dakika daldırın.
   DİKKAT: Limonen 50 °C'de yanıcıdır ve alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Göz koruması ve eldivenli bir çeker ocak altında kullanın. Açık ateşten uzak tutun.
2. Kayar rafı iki kez %100 etanole ve bir kez %96 etanole, %90 etanole, %80 etanole ve %70 etanole her biri 5 dakika daldırarak numuneleri azalan bir etanol serisinde yeniden sulandırın.
3. Kalan etanolü temizlemek için sürgülü rafı 5 dakika boyunca deiyonize suya (DI su) daldırın.

3. Otofloresan bloke etme ve antijen alımı

1. Veri sayfasına göre pH 6 sitrat hedef alma çözeltisini (TRS) (Malzeme Tablosu) hazırlayın. Bu TRS 10 kez konsantre edilmiştir. Bu nedenle 1:10 oranında DI su ile seyreltin. Plastik bir boyama kavanozunda 96 °C'ye ısıtın.
   NOT: TRS, antijen epitoplarını açığa çıkarmak için numune fiksasyonu sırasında oluşan metilen köprülerini kırar. Bu, birincil antikorların hedef antijenlerine bağlanmasına izin verir. Konsantre TRS'yi 2-8 °C'de 8 ay saklayın. Her zaman taze TRS hazırlayın.
2. Slaytları sürgülü raftan çıkarın ve ıslak bir odaya yerleştirin. Her numuneye bir ila iki damla otofloresan azaltıcı madde (Malzeme Tablosu) pipetleyin. 5 dakika inkübe edin.
   NOT: Otofloresan azaltıcı ajan, endojen floroforlar ve fiksatiflerin neden olduğu doğal doku otofloresansını bloke eder. Otofloresan azaltıcı ajanı RT'de 1 yıla kadar saklayın.
   NOT: Numunelerin kurumasını veya inkübasyon süresini aşmasını önlemek için yalnızca küçük doku bölümleriyle çalışın.
3. Slaytları tekrar sürgü rafına istifleyin ve kullanılmayan tüm otofloresan azaltıcı reaktif yıkanana kadar yukarı ve aşağı hareketlerle %60 etanol içinde 1 dakika durulayın.
4. Sürgülü rafı 5 dakika boyunca DI suya daldırın.
5. Antijen alımı için, slaytları önceden ısıtılmış TRS ile bir boyama kavanozuna aktarın. Bir su banyosunda 96 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
   NOT: TRS 96 °C'ye önceden ısıtılırsa ve 96 °C'de 10 dakikalık inkübasyon süresi sağlanırsa, 96 °C'lik su banyosu bir mikrodalga fırın veya buharlı pişirici ile ikame edilebilir.
6. Boyama kavanozunu çıkarın ve yaklaşık 60-90 dakika RT'ye kadar yavaşça soğumaya bırakın.
   NOT: Protokol burada 4 saate kadar duraklatılabilir ve slaytlar TRS'de bırakılabilir.
7. TRS'yi çıkarın, ancak slaytları kavanozda saklayın. Kalan TRS kalıntılarını yıkamak için her biri 3 dakika boyunca %0.05 Tween (TBST, pH 7.4) içeren Tris tamponlu salin ile iki kez durulayın.
8. Geçirgenlik için, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde% 0.2 Triton hazırlayın ve numuneleri 10 dakika geçirgenleştirmek için boyama kavanozuna doldurun.
   NOT: Permeabilizasyon, primer antikorların sabit numunelerdeki hücre içi hedef proteinlere bağlanmasını arttırır.
9. Slaytları her seferinde 3 dakika boyunca TBST'de iki kez tekrar durulayın.
10. Islak hazneyi hazırlayın ve slaytları yerleştirin. Slaytlardaki fazla suyu kağıt mendillerle silin. Antikor çözeltisinin akmasını önlemek için her numuneyi hidrofobik bir bariyer kalemle daire içine alın.
    NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. Küçük bölümlerle çalışmak en iyisidir.

4. Spesifik olmayan antikor bağlanmasının engellenmesi

1. Eşek serumu (Malzeme Tablosu) ile kullanıma hazır engelleme solüsyonu alın ve her numuneye bir damla pipetleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu bloke edici adım, ikincil antikorun numune üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerine bağlanmasını en aza indirir. Bu spesifik olmayan epitopları bloke ettikten ve birincil antikoru uyguladıktan sonra, ikincil antikor birincil antikora bağlanacak ve dokunun yüzeyi ile etkileşime girmeyecektir. Bu kullanıma hazır bloke edici reaktif, 6 ay boyunca 2-8 °C'de saklanır.
2. Kızakların kenarını sert bir yüzeye vurarak fazla engelleme solüsyonunu slaytlardan çıkarın. Onları durulamayın.

5. Birincil antikor

1. Antikor seyreltme tamponundaki primer antikorları seyreltin (Malzeme Tablosu). Her numune için yaklaşık 100 μL nihai çözelti kullanın. NE ve H3cit (R8) antikoru ve izokontrolü için 5 μg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. MPO ve karşılık gelen izokontrol için 10 μg/mL kullanın. Her primer antikor için bir tüp ve her izokontrol antikoru için bir tüp hazırlayın.
   NOT: H3cit (R8)/MPO veya NE/MPO ve bunların izokontrolleri NET'lerin boyanması için birleştirilebilir. H3cit (R8)/MPO kombinasyonu için, H3cit (R8) için 5 μg/mL ve MPO için 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. NE / MPO için, NE için 5 μg / mL ve MPO için 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona, numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. İzokontrol için, karşılık gelen her bir antikor ile aynı konsantrasyonu kullanın. Kullanılan her antikor için her zaman yeni bir pipet ucu kullanın. Primer antikorlar 4 °C'de 1-2 hafta ve −20 °C veya −80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
2. Bir slaytta iki numune ile, izokontrol antikorları için bir tane ve MPO / H3cit veya MPO / NE antikor seyreltmesi için bir tane kullanın. Her numune için yaklaşık 100 μL kullanın ve antikor solüsyonunu eşit şekilde yayın.
   NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. İzokontrol ve primer antikorları karıştırmaktan kaçınmaya dikkat edin.
3. Islak bir odada gece boyunca 4 °C'de saklayın.
4. Ertesi gün, slaytlardaki fazla primer antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları bir küvette istifleyin. Kalan primer antikor solüsyonunu yıkamak için her seferinde TBST ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın.

6. İkincil antikor

1. İkincil antikor çözeltisini hazırlayın. İki farklı floresan sekonder antikor kullanın: MPO için eşek anti-keçi ve H3cit boyama için eşek anti-tavşan. Her birini antikor seyreltme tamponu ile 7.5 μg/mL konsantrasyona seyreltin (Malzeme Tablosu).
   NOT: Çift boyama için, farklı uyarma alanlarına ve minimum spektral örtüşmeye sahip iki floresan antikor kullanın. Her iki ikincil antikoru birleştirin ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacim için her bir antikor için 7.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Antikorları ışıktan koruyun. İkincil antikorlar 2-8 °C'de 6-8 hafta veya -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
2. Slaytları ıslak odada tutun ve her numuneye 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe etmelerine izin verin ve ışıktan koruyun.
3. Fazla ikincil antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları sürgülü rafa istifleyin. Kalan bağlanmamış antikorları yıkamak için PBS ile dolu bir boyama kavanozuna her biri 5 dakika boyunca üç kez daldırın.
4. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve DI su ile 1 μg/mL konsantrasyona seyreltin. Sürgülü rafı DAPI solüsyonu ile bir boyama kavanozuna daldırın ve karanlıkta RT'de 5 dakika inkübe edin.
   NOT: DAPI, çift sarmallı DNA için floresan lekesi olarak kullanılır. Hazırlanan DAPI çözeltisi birden çok kez kullanılabilir. Hazırlanan DAPI çözeltisini RT'de saklayın. DAPI konsantresi −20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
5. Fazla DAPI solüsyonunu yıkamak için sürgülü rafı 5 dakika boyunca PBS'li bir boyama kavanozuna daldırın.

7. Numunelerin montajı ve saklanması, mikroskobik analiz

1. Numuneleri lameller ve montaj ortamı ile monte edin (Malzeme Tablosu).
   NOT: Yalnızca az miktarda montaj ortamı kullanın ve fazla ortamı ıslak mendillerle silin. Eldiven giyin ve lameller veya slaytlardan herhangi bir ortamı yanlışlıkla silmekten kaçının. Kabarcık oluşumundan kaçının ve slaytlardaki kabarcıkları gidermek için lamellere hafifçe bastırmak için pamuklu çubuklar kullanın.
2. Görüntüleme için geniş alan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın.
   NOT: Önce izokontrolün bir görüntüsünü alın. Floresan filtrelerin (DAPI için mavi filtre hariç) maruz kalma süresini neredeyse hiç sinyal algılanmayana kadar azaltın. Ardından, ilgili örnekleri incelemek için bu ayarı kullanın. Floresan kanalını kullanarak her bir numunede bir floresan sinyalinin tespit edilebileceği alanları arayın. Alanın bir görüntüsünü aldıktan sonra, program tüm kanalların bileşik bir görüntüsünü oluşturur ve farklı floresan sinyallerini farklı renklerin üst üste binmesi olarak gösterir. Görüntü daha sonra ImageJ gibi görüntüleme yazılımlarıyla birlikte yerelleştirme için daha fazla analiz edilebilir.
3. Slaytları 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.

Sonuçlar

Protokol optimizasyonumuza başlamadan önce, NET'lerin immün boyanması için FFPE dokusu kullanan çalışmalar için PubMed'de arama yaparak başarılı boyama için temel adımları belirledik ve protokollerini karşılaştırdık. En umut verici protokol farklılıkları, protokol optimizasyonu için anahtar adımlar olarak belirlenirken, çoğunlukla birbirine karşılık gelen adımlar değiştirilmemiştir (Tablo 1).

Tablo 1: NET'lerin FFPE immün boyaması i?...

Tartışmalar

Bu çalışmada, gerçek boyama işleminden başlayarak, NET'lerin görüntülenmesi için mevcut protokolleri daha fazla doku tipine uyarlamayı ve optimize etmeyi amaçladık. Bu yöntem için ilk kritik adım, en uygun antikorların seçilmesidir. NE için, insan dokusu üzerinde bir fare konakçısından bir NE antikoru denedik, bu da bir tavşan konakçısından alınan NE'ye kıyasla güvenilir bir lekelenme göstermedi. Ayrıca, Thålin ve ark. hücre dışı boyama için daha spesifik bir antikor olarak H3cit (R8...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M