İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyona veya travmatik doku hasarına yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır, ancak aynı zamanda otoimmün hastalıklarda ve steril inflamasyonda da rol oynar. Çift sarmallı DNA filamentleri, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. Serbest bırakıldıktan sonra, NET'ler kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayabilir ve öldürebilir. Ayrıca, NET'ler trombosit adezyonunu ve pıhtılaşmayı uyararak homeostatik regülasyona katılırlar. Bununla birlikte, NET'lerin düzensiz üretimi, sepsis veya otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir ve bu da onları terapötik müdahale için umut verici bir hedef haline getirmektedir. Elektron mikroskobunun yanı sıra, immünofloresan görüntüleme kullanılarak NET'lerin görüntülenmesi, şu anda dokudaki NET etkileşimlerini göstermek için bilinen tek yöntemlerden biridir. Bu nedenle, NET'leri görselleştirmek için çeşitli boyama yöntemleri kullanılmıştır. Literatürde farklı boyama protokolleri tanımlanmış ve protokoller arasında yüksek değişkenlik gösteren dört anahtar bileşen tanımlanmıştır: (1) kullanılan antikor tipleri, (2) otofloresan azaltıcı ajanların kullanımı, (3) antijen elde etme yöntemleri ve (4) geçirgenlik. Bu nedenle, in vitro immünofloresan boyama protokolleri, farklı türler (fare, insan) ve dokular (cilt, bağırsak, akciğer, karaciğer, kalp, omurilik) için uygulanabilir hale getirmek için bu çalışmada sistematik olarak uyarlanmış ve geliştirilmiştir. Fiksasyon ve parafin gömüldükten sonra 3 μm kalınlığındaki kesitler slaytlara monte edildi. Bu örnekler, modifiye bir boyama protokolüne göre miyeloperoksidaz (MPO), sitrüline histon H3 (H3cit) ve nötrofil elastaz (NE) için birincil antikorlarla boyandı. Slaytlar sekonder antikorlarla boyandı ve geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Sonuçlar bir değerlendirme formuna göre analiz edildi ve farklılıklar yarı nicel olarak kaydedildi.

Burada, farklı dokular için uygun optimize edilmiş bir NET boyama protokolü sunuyoruz. H3cit için boyama yapmak için yeni bir primer antikor kullandık ve otofloresan indirgeyici bir ajan ile spesifik olmayan boyamayı azalttık. Ayrıca, NET boyamanın sabit bir yüksek sıcaklık ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirdiğini gösterdik.

Giriş

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) ilk olarak Brinkmann ve ark. 2004^yılında apoptoz ve nekrozdan farklı bir hücresel ölüm yolu olarak 1. Bu yolda, nötrofiller, daha önce granüllerde veya sitozolde depolanan antimikrobiyal proteinlerle kaplı büyük ağ benzeri yapılar oluşturmak için yoğunlaştırılmış kromatinlerini hücre dışı boşluğa bırakırlar. Bu antimikrobiyal proteinler, NET'lerin dolaylı immünofloresan tespiti için yaygın olarak kullanılan nötrofil elastaz (NE), miyeloperoksidaz (MPO) ve sitrüline histon H3'ü (H3cit) içerir². Bu yöntem sadece bu proteinlerin kantitatif varlığını tanımlamakla kalmaz; gerçekten de, N....

Protokol

Bu çalışma, Hamburg Eyalet Hayvan Araştırmaları İdaresi, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Almanya (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16) tarafından onaylanan deneylerden elde edilen fare dokularını içermektedir. Kullanılan dokular septik bir modelden fare akciğeri ve kolon ve yanmış deriydi. 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullandık. Tüm deneyler için bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uyulmuştur. Anonimleştirilmiş insan örnekleri, yenidoğan enterokolit, yanmış cilt, biliyer atrezi, spondilodiskit ve miyokard dokularını içeriyordu. Hamburg Tıbbi Araştırma Etik Kurulu'na göre, numuneler....

Tartışmalar

Bu çalışmada, gerçek boyama işleminden başlayarak, NET'lerin görüntülenmesi için mevcut protokolleri daha fazla doku tipine uyarlamayı ve optimize etmeyi amaçladık. Bu yöntem için ilk kritik adım, en uygun antikorların seçilmesidir. NE için, insan dokusu üzerinde bir fare konakçısından bir NE antikoru denedik, bu da bir tavşan konakçısından alınan NE'ye kıyasla güvenilir bir lekelenme göstermedi. Ayrıca, Thålin ve ark. hücre dışı boyama için daha spesifik bir antikor olarak H3cit (R8.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M