Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Resumo

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Resumo

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são liberadas pelos neutrófilos como resposta à infecção bacteriana ou dano traumático do tecido, mas também desempenham um papel em doenças autoimunes e inflamação estéril. São estruturas semelhantes a teias compostas por filamentos de DNA de fita dupla, histonas e proteínas antimicrobianas. Uma vez liberados, os NETs podem capturar e matar patógenos extracelulares no sangue e no tecido. Além disso, os TNEs participam da regulação homeostática, estimulando a adesão plaquetária e a coagulação. No entanto, a produção desregulada de TNEs também tem sido associada a várias doenças, incluindo sepse ou doenças autoimunes, o que as torna um alvo promissor para intervenção terapêutica. Além da microscopia eletrônica, a visualização de NETs usando imagens de imunofluorescência é atualmente um dos únicos métodos conhecidos para demonstrar interações de NET no tecido. Portanto, vários métodos de coloração para visualização de NETs têm sido utilizados. Na literatura, diferentes protocolos de coloração são descritos, e identificamos quatro componentes-chave mostrando alta variabilidade entre os protocolos: (1) os tipos de anticorpos utilizados, (2) o uso de agentes redutores de autofluorescência, (3) métodos de recuperação de antígenos e (4) permeabilização. Portanto, os protocolos de coloração por imunofluorescência in vitro foram adaptados e aprimorados sistemicamente neste trabalho para torná-los aplicáveis a diferentes espécies (camundongo, humano) e tecidos (pele, intestino, pulmão, fígado, coração, disco vertebral). Após fixação e inclusão em parafina, cortes de 3 μm de espessura foram montados sobre as lâminas. Essas amostras foram coradas com anticorpos primários para mieloperoxidase (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) e elastase neutrofílica (NE) de acordo com um protocolo de coloração modificado. As lâminas foram coradas com anticorpos secundários e examinadas em microscópio de fluorescência de campo largo. Os resultados foram analisados de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de coloração NET adequado para diferentes tecidos. Usamos um novo anticorpo primário para corar para H3cit e reduzimos a coloração inespecífica com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, demonstramos que a coloração NET requer uma alta temperatura constante e manuseio cuidadoso das amostras.

Introdução

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram visualizadas pela primeira vez por Brinkmann e col. como uma via de morte celular diferente da apoptose e necrose em 2004¹. Nessa via, os neutrófilos liberam sua cromatina descondensada no espaço extracelular para formar grandes estruturas semelhantes a teias cobertas por proteínas antimicrobianas que antes eram armazenadas nos grânulos ou citosol. Essas proteínas antimicrobianas incluem elastase neutrofílica (NE), mieloperoxidase (MPO) e histona citrulinada H3 (H3cit), que são comumente usadas para detecção por imunofluorescência indireta de NETs². Esse método não apenas identifica a presença quantitativa dessas proteínas; na verdade, ele tem a vantagem de detectar especificamente estruturas semelhantes à NET. Nas NETs, as proteínas mencionadas co-localizam-se com o DNA extracelular, que pode ser detectado por uma sobreposição dos sinais de fluorescência de cada proteína corada e do DNA extracelular. Em contraste com os sinais de sobreposição devido ao DNA extracelular e à co-localização de proteínas em NETs, os neutrófilos intactos não mostram co-localização. Aqui, os componentes NET são geralmente armazenados separadamente nos grânulos, núcleos e citosol³.

Desde sua primeira descoberta, tem sido demonstrado que as NETs desempenham um papel central em inúmeras doenças, particularmente aquelas que envolvem inflamação. Os TNEs apresentam funções antimicrobianas durante a infecção através do aprisionamento e morte de patógenos extracelulares no sangue e nos tecidos ^4,5. No entanto, os TNEs também têm sido associados a doenças autoimunes e respostas hiperinflamatórias, como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumática e asma alérgica ^6,7,8. Os TNEs promovem vaso-oclusão e inflamação na aterosclerose, adesão plaquetária e especula-se que desempenhem um papel no câncer metastático 9,10,11. No entanto, acredita-se que tenham propriedades anti-inflamatórias, reduzindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias¹². Embora as NETs estejam ganhando mais interesse em um campo mais amplo de pesquisa, um método robusto de detecção de NET é fundamental para pesquisas futuras.

Embora a visualização de NETs em diferentes tecidos por imunofluorescência seja complexa e necessite de personalização, além da microscopia eletrônica, é atualmente um dos métodos mais renomados para visualizar as interações entre NETs e células, sendo predominantemente utilizada em tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE)^13,14. No entanto, a comparação de imagens NET é difícil, pois diferentes laboratórios usam seus próprios protocolos personalizados. Esses protocolos diferem no uso de anticorpos, recuperação de antígenos ou método de permeabilização e são frequentemente otimizados para um tipo específico de tecido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27º.

Após Brinkmann e col. publicarem o primeiro estudo metódico utilizando a visualização imunofluorescente de NETs em tecido FFPE, quisemos otimizar esse protocolo para uma maior variedade de tecidos e espécies¹⁵. Além disso, para estabelecer um protocolo de imunofluorescência amplamente aplicável, testamos diferentes protocolos modificados de estudos que utilizaram métodos de imunofluorescência em tecido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Além disso, tentamos um novo anticorpo contra H3cit para coloração extracelular mais específica²⁸. Nós hipotetizamos que, adaptando sistematicamente os protocolos de coloração atuais para diferentes espécies e tecidos, a imagem in vitro pode ser melhorada, resultando em uma melhor representação da interação entre neutrófilos e NETs tanto local quanto sistemicamente.

Protocolo

Este estudo incluiu tecidos de camundongos derivados de experimentos aprovados pela Administração Estadual de Pesquisa Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemanha (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Os tecidos utilizados foram pulmão e cólon de camundongo de modelo séptico e pele queimada. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com 8 semanas de idade. A Diretiva Europeia 2010/63/UE relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos foi seguida em todas as experiências. As amostras humanas anonimizadas incluíram tecidos de enterocolite neonatal, pele queimada, atresia biliar, espondilodiscite e miocárdio. De acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa Médica de Hamburgo, as amostras não necessitaram de consentimento informado, mas o estudo foi aprovado pelo comitê (WF-026/21).

1. Fixação da amostra

1. Utilizar o seguinte protocolo derivado de Abu Abed e Brinkmann para fixação da amostra, desidratação, incorporação em parafina, seccionamento e montagem ^3,15.
   1. Preparar solução de formaldeído a 4% dissolvendo 40 g de paraformaldeído (PFA) em 800 ml de solução salina tamponada com Tris, pH 7,4 (TBS).
   2. Agitar a mistura a 60 °C sob um exaustor até dissolver o PFA. Levar a solução à temperatura ambiente (TR) e ajustar o volume com TBS para 1.000 mL.
   3. Ajuste o pH para 7,4. Conservar a 4 °C durante 2-3 semanas ou a -20 °C até 1 ano.
2. Para fixação da amostra, colocar o tecido fresco em tampão TBS e dissecar em pedaços menores que 20 mm x 30 mm x 3 mm. Imergir os cortes de tecido em solução de paraformaldeído a 4% por 12-24 horas.
   NOTA: O protocolo original utilizava uma solução de PFA a 2% e um tempo de fixação de 8-20 h. Com esse método, alguns cortes teciduais não foram completamente fixados após 20 h, de modo que a concentração de PFA foi aumentada para 4% de PFA.
3. Transfira as amostras para de processamento de tecidos marcados. Use marcadores resistentes a solventes ou lápis para rotulagem.
4. Iniciar a desidratação da amostra imergindo em seguida os em etanol 70% por 1 h. Em seguida, mergulhe em etanol 80%, etanol 90%, etanol 96% e duas vezes em etanol 100%, com cada etapa durando 1 h.
5. Imergir duas vezes em xileno a 100% (dimetilbenzeno) e, em seguida, duas vezes em parafina a 60 °C durante 1 h de cada vez.
6. Use moldes de embutimento para montagem e deixe a parafina solidificar antes de remover o molde.
7. Use um micrótomo para cortar cortes de tecido de 3 μm de espessura.
8. Use uma pinça para colocar as seções cortadas em banho-maria a 37 °C e deixe-as flutuar na superfície para esticar os cortes de tecido.
9. Coloque as seções em lâminas de vidro adesivo (Tabela de Materiais) e deixe-as secar durante a noite em uma câmara de calor de 40 °C.

2. Reidratação da amostra

1. Para a desparafinização, empilhar as lâminas em um rack de corrediças e submergir duas vezes por 5 min cada no limoneno médio de reposição de xileno (Tabela de Materiais) e uma vez por 5 min em uma mistura de limoneno/etanol 1:1.
   CUIDADO: O limoneno é inflamável a 50 °C e pode causar reações alérgicas. Use sob um exaustor com proteção para os olhos e luvas. Manter longe de fogo aberto.
2. Reidratar as amostras em uma série descendente de etanol submergindo a prateleira duas vezes em etanol 100% e uma vez em etanol 96%, etanol 90%, etanol 80% e etanol 70% por 5 min cada.
3. Submergir o rack deslizante por 5 min em água deionizada (água DI) para limpar qualquer etanol restante.

3. Bloqueio de autofluorescência e recuperação de antígenos

1. Preparar solução de recuperação alvo de citrato (TRS) pH 6 (Tabela de Materiais) de acordo com a ficha técnica. Este TRS é concentrado 10 vezes. Portanto, diluir 1:10 com água DI. Pré-aqueça em um frasco de coloração plástico a 96 °C.
   NOTA: O TRS quebra as pontes de metileno formadas durante a fixação da amostra para expor os epítopos do antígeno. Isso permite que os anticorpos primários se liguem ao antígeno alvo. Conservar TRS concentrado a 2-8 °C durante 8 meses. Prepare sempre TRS fresco.
2. Retire as corrediças do rack de slides e coloque-as em uma câmara molhada. Pipetar uma a duas gotas de agente redutor de autofluorescência (Tabela de Materiais) em cada amostra. Incubar por 5 min.
   NOTA: O agente redutor de autofluorescência bloqueia a autofluorescência tecidual inerente causada por fluoróforos endógenos e fixadores. Armazene o agente redutor de autofluorescência em RT por até 1 ano.
   NOTA: Trabalhe apenas com pequenas seções de tecidos para evitar o ressecamento das amostras ou exceder o tempo de incubação.
3. Empilhe as lâminas de volta no rack deslizante e enxágue por 1 min em etanol a 60% usando um movimento ascendente e descendente até que todo o reagente redutor de autofluorescência não utilizado tenha sido lavado.
4. Submerja o rack deslizante por 5 min em água DI.
5. Para recuperação de antígeno, transfira as lâminas para um frasco de coloração com o TRS pré-aquecido. Incubar durante 10 min a 96 °C em banho-maria.
   NOTA: O banho-maria de 96 °C pode ser substituído por um micro-ondas ou fogão a vapor se o TRS for pré-aquecido a 96 °C e 10 min de tempo de incubação a 96 °C for assegurado.
6. Retire o frasco de coloração e deixe esfriar lentamente por aproximadamente 60-90 min.
   OBS: O protocolo pode ser pausado aqui por até 4 h, deixando os slides no TRS.
7. Retire o TRS, mas mantenha as lâminas no frasco. Enxaguar duas vezes com solução salina tamponada com Tris com Tween 0,05% (TBST, pH 7,4) por 3 min cada para lavar os resíduos de TRS que sobraram.
8. Para permeabilização, preparar Triton 0,2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, e preenchê-lo no frasco de coloração para permeabilizar as amostras por 10 min.
   NOTA: A permeabilização aumenta a ligação dos anticorpos primários com as proteínas-alvo intracelulares nas amostras fixas.
9. Enxágue as lâminas novamente duas vezes em TBST por 3 min de cada vez.
10. Prepare a câmara molhada e deite escorregadores. Limpe o excesso de água das lâminas com lenços de papel. Circule cada amostra com uma caneta de barreira hidrofóbica para evitar que a solução de anticorpos se esgote.
    OBS: Não deixe as amostras secarem. É melhor trabalhar com seções pequenas.

4. Bloqueio da ligação de anticorpos inespecíficos

1. Tome solução de bloqueio pronta para uso com soro de burro (Tabela de Materiais) e pipete uma gota em cada amostra. Incubar por 30 min no TR.
   Observação : esta etapa de bloqueio minimiza a ligação do anticorpo secundário a locais de ligação inespecíficos na amostra. Após o bloqueio desses epítopos inespecíficos e a aplicação do anticorpo primário, o anticorpo secundário se ligará ao anticorpo primário e não interagirá com a superfície do tecido. Este reagente de bloqueio pronto a utilizar é armazenado a 2-8 °C durante 6 meses.
2. Remova o excesso de solução de bloqueio das lâminas tocando a borda das lâminas contra uma superfície dura. Não enxágue.

5. Anticorpo primário

1. Diluir anticorpos primários em tampão de diluição de anticorpos (Tabela de Materiais). Utilizar aproximadamente 100 μL da solução final para cada amostra. Para o anticorpo NE e H3cit (R8) e isocontrole, diluir a uma concentração de 5 μg/mL. Para MPO e isocontrole correspondente, utilizar 10 μg/mL. Prepare um tubo para cada anticorpo primário e um para cada anticorpo isocontrole.
   NOTA: H3cit (R8)/MPO ou NE/MPO e seus isocontroles podem ser combinados para coloração de NETs. Para a combinação de H3cit (R8)/MPO, diluir até uma concentração final de 5 μg/mL para H3cit (R8) e 10 μg/mL para MPO até um volume final de 100 μL por amostra. Para NE/MPO, diluir até uma concentração final de 5 μg/mL para NE e 10 μg/mL para MPO até um volume final de 100 μL por amostra. Para o isocontrole, use a mesma concentração que para cada anticorpo correspondente. Use sempre uma nova ponta de pipeta para cada anticorpo utilizado. Os anticorpos primários podem ser armazenados a 4 °C por 1-2 semanas e a -20 °C ou -80 °C por até 1 ano.
2. Com duas amostras em uma lâmina, utilizar uma para os anticorpos de isocontrole e outra para a diluição de anticorpos MPO/H3cit ou MPO/NE. Use aproximadamente 100 μL para cada amostra e espalhe a solução de anticorpos uniformemente.
   OBS: Não deixe as amostras secarem. Tenha cuidado para evitar misturar o isocontrole e os anticorpos primários.
3. Conservar numa câmara húmida durante a noite a 4 °C.
4. No dia seguinte, retire o excesso de solução de anticorpos primários das lâminas e empilhe as lâminas em uma cubeta. Enxaguar três vezes por 5 min cada vez com TBST para lavar a solução de anticorpos primários restante.

6. Anticorpo secundário

1. Preparar a solução de anticorpos secundários. Use dois anticorpos secundários fluorescentes diferentes: burro-anti-cabra para MPO e burro-anti-coelho para coloração de H3cit. Diluir cada um deles na concentração de 7,5 μg/mL com tampão de diluição de anticorpos (Tabela de Materiais).
   NOTA: Para dupla coloração, use dois anticorpos fluorescentes com áreas de excitação diferentes e sobreposição espectral mínima. Combinar ambos os anticorpos secundários e diluir até uma concentração final de 7,5 μg/mL para cada anticorpo para um volume final de 100 μL por amostra. Proteger os anticorpos da luz. Os anticorpos secundários podem ser armazenados a 2-8 °C por 6-8 semanas ou a -80 °C por até 1 ano.
2. Mantenha as lâminas na câmara húmida e adicione 100 μL da solução de anticorpos secundários em cada amostra. Deixe incubar por 30 min no RT e protegido da luz.
3. Toque na solução de anticorpos secundários em excesso e empilhe as lâminas no rack de slides. Submergir três vezes por 5 min cada em um frasco de coloração cheio de PBS para lavar os anticorpos não ligados restantes.
4. Preparar a solução de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Tabela de Materiais) e diluir até uma concentração de 1 μg/mL com água DI. Submergir o rack de slides em um frasco de coloração com solução DAPI e incubar por 5 min em RT no escuro.
   NOTA: DAPI é usado como uma coloração fluorescente para DNA de fita dupla. A solução DAPI preparada pode ser usada várias vezes. Armazene a solução DAPI preparada no RT. O concentrado DAPI pode ser armazenado a -20 °C por até 1 ano.
5. Submergir o rack deslizante por 5 min em um frasco de coloração com PBS para lavar o excesso de solução DAPI.

7. Montagem e armazenamento das amostras, análise microscópica

1. Monte as amostras com lamínulas e meio de montagem (Tabela de Materiais).
   NOTA: Use apenas pequenas quantidades de meio de montagem e limpe o meio em excesso com tecidos molhados. Use luvas e evite limpar acidentalmente qualquer meio das tampas ou corrediças. Evite a formação de bolhas e use cotonetes para pressionar suavemente as lamínulas para remover quaisquer bolhas das lâminas.
2. Para aquisição de imagens, use um microscópio de campo largo ou um microscópio confocal.
   NOTA: Tire uma imagem do isocontrol primeiro. Diminua o tempo de exposição para os filtros de fluorescência (exceto o filtro azul para DAPI) até que quase nenhum sinal possa ser detectado. Em seguida, use essa configuração para examinar as amostras correspondentes. Procure áreas onde um sinal fluorescente pode ser detectado em cada amostra individual usando o canal de fluorescência. Depois de tirar uma imagem da área, o programa gera uma imagem composta de todos os canais e mostra os diferentes sinais de fluorescência como uma sobreposição de cores diferentes. A imagem pode então ser analisada para co-localização com software de imagem como o ImageJ.
3. Conservar as lâminas a 4 °C até 6 meses.

Resultados

Antes de iniciar nossa otimização de protocolo, identificamos os principais passos para o sucesso da coloração, pesquisando no PubMed estudos que utilizaram tecido FFPE para a imunomarcação de NETs e comparamos seus protocolos. As diferenças de protocolo mais promissoras foram identificadas como os passos chave para a otimização do protocolo, enquanto os passos que correspondiam em sua maioria não foram alterados (Tabela 1).

Tabela 1: Pesquisa PubMed para imu...

Discussão

Neste trabalho, nosso objetivo foi adaptar e otimizar os protocolos existentes de obtenção de imagens de TNEs para mais tipos de tecidos, começando pelo processo de coloração propriamente dito. O primeiro passo crítico para este método é a seleção dos anticorpos mais adequados. Para NE, tentamos um anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo em tecido humano, que não mostrou coloração confiável em comparação com NE de um hospedeiro coelho. Além disso, Thålin et al., propuseram o H3cit (R8) como um antic...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M