Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Resumo

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Resumo

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são liberadas pelos neutrófilos como resposta à infecção bacteriana ou dano traumático do tecido, mas também desempenham um papel em doenças autoimunes e inflamação estéril. São estruturas semelhantes a teias compostas por filamentos de DNA de fita dupla, histonas e proteínas antimicrobianas. Uma vez liberados, os NETs podem capturar e matar patógenos extracelulares no sangue e no tecido. Além disso, os TNEs participam da regulação homeostática, estimulando a adesão plaquetária e a coagulação. No entanto, a produção desregulada de TNEs também tem sido associada a várias doenças, incluindo sepse ou doenças autoimunes, o que as torna um alvo promissor para intervenção terapêutica. Além da microscopia eletrônica, a visualização de NETs usando imagens de imunofluorescência é atualmente um dos únicos métodos conhecidos para demonstrar interações de NET no tecido. Portanto, vários métodos de coloração para visualização de NETs têm sido utilizados. Na literatura, diferentes protocolos de coloração são descritos, e identificamos quatro componentes-chave mostrando alta variabilidade entre os protocolos: (1) os tipos de anticorpos utilizados, (2) o uso de agentes redutores de autofluorescência, (3) métodos de recuperação de antígenos e (4) permeabilização. Portanto, os protocolos de coloração por imunofluorescência in vitro foram adaptados e aprimorados sistemicamente neste trabalho para torná-los aplicáveis a diferentes espécies (camundongo, humano) e tecidos (pele, intestino, pulmão, fígado, coração, disco vertebral). Após fixação e inclusão em parafina, cortes de 3 μm de espessura foram montados sobre as lâminas. Essas amostras foram coradas com anticorpos primários para mieloperoxidase (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) e elastase neutrofílica (NE) de acordo com um protocolo de coloração modificado. As lâminas foram coradas com anticorpos secundários e examinadas em microscópio de fluorescência de campo largo. Os resultados foram analisados de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de coloração NET adequado para diferentes tecidos. Usamos um novo anticorpo primário para corar para H3cit e reduzimos a coloração inespecífica com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, demonstramos que a coloração NET requer uma alta temperatura constante e manuseio cuidadoso das amostras.

Introdução

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram visualizadas pela primeira vez por Brinkmann e col. como uma via de morte celular diferente da apoptose e necrose em 2004¹. Nessa via, os neutrófilos liberam sua cromatina descondensada no espaço extracelular para formar grandes estruturas semelhantes a teias cobertas por proteínas antimicrobianas que antes eram armazenadas nos grânulos ou citosol. Essas proteínas antimicrobianas incluem elastase neutrofílica (NE), mieloperoxidase (MPO) e histona citrulinada H3 (H3cit), que são comumente usadas para detecção por imunofluorescência indireta de NETs². Esse método não....

Protocolo

Este estudo incluiu tecidos de camundongos derivados de experimentos aprovados pela Administração Estadual de Pesquisa Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemanha (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Os tecidos utilizados foram pulmão e cólon de camundongo de modelo séptico e pele queimada. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com 8 semanas de idade. A Diretiva Europeia 2010/63/UE relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos foi seguida em todas as experiências. As amostras humanas anonimizadas incluíram tecidos de enterocolite neonatal, pele queimada, atresia biliar, espondilodiscite e miocárdio. De....

Discussão

Neste trabalho, nosso objetivo foi adaptar e otimizar os protocolos existentes de obtenção de imagens de TNEs para mais tipos de tecidos, começando pelo processo de coloração propriamente dito. O primeiro passo crítico para este método é a seleção dos anticorpos mais adequados. Para NE, tentamos um anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo em tecido humano, que não mostrou coloração confiável em comparação com NE de um hospedeiro coelho. Além disso, Thålin et al., propuseram o H3cit (R8) como um antic.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M