ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

要約

好中球細胞外トラップ(NET)はさまざまな疾患と関連しており、その可視化には免疫蛍光法がよく用いられます。しかし、染色プロトコルは様々であり、多くの場合、1種類の組織しか検査されません。ここでは、マウスおよびヒト組織におけるNETsの染色に一般的に適用可能なプロトコルを確立します。

要約

好中球細胞外トラップ(NET)は、細菌感染または外傷性組織損傷に対する応答として好中球によって放出されますが、自己免疫疾患および不妊性炎症にも関与します。これらは、二本鎖DNAフィラメント、ヒストン、および抗菌タンパク質で構成される網状の構造です。いったん放出されると、NETは血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることができます。さらに、NETは血小板の接着と凝固を刺激することにより、恒常性調節に関与します。しかし、NETの産生不全は、敗血症や自己免疫疾患などのさまざまな疾患とも関連しており、治療的介入の有望な標的となっています。電子顕微鏡法とは別に、免疫蛍光イメージングを用いたNETの可視化は、現在、組織におけるNET相互作用を実証する唯一の既知の方法の1つです。そのため、NETを可視化するための様々な染色法が利用されています。文献には、さまざまな染色プロトコルが記載されており、プロトコル間で大きなばらつきを示す4つの主要コンポーネントを特定しました:(1)使用する抗体の種類、(2)自家蛍光低減剤の使用、(3)抗原賦活化法、および(4)透過化。したがって、in vitro 免疫蛍光染色プロトコルは、異なる種(マウス、ヒト)および組織(皮膚、腸、肺、肝臓、心臓、脊椎椎間板)に適用できるように、この作業で体系的に適応および改善されました。固定とパラフィン包埋の後、厚さ3μmの切片をスライドに取り付けました。これらのサンプルは、修正された染色プロトコルに従って、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、シトルリン化ヒストンH3(H3cit)、および好中球エラスターゼ(NE)の一次抗体で染色しました。スライドを二次抗体で染色し、広視野蛍光顕微鏡で調べました。その結果を評価シートに従って分析し、その差を半定量的に記録した。

ここでは、さまざまな組織に適した最適化されたNET染色プロトコルを紹介します。新規一次抗体を用いてH3citを染色し、自家蛍光低減剤で非特異的染色を低減しました。さらに、NET染色には、一定の高温とサンプルの慎重な取り扱いが必要であることを実証しました。

概要

好中球細胞外トラップ(NET)は、2004年にBrinkmannらによって、アポトーシスや壊死とは異なる細胞死の経路として初めて可視化^{されました1。}この経路では、好中球は脱凝縮したクロマチンを細胞外空間に放出し、以前は顆粒または細胞質に保存されていた抗菌タンパク質で覆われた大きなウェブ状の構造を形成します。これらの抗菌タンパク質には、好中球エラスターゼ(NE)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびシトルリン化ヒストンH3(H3cit)が含まれ、これらはNET^の間接免疫蛍光検出に一般的に使用されます2。この方法は、これらのタンパク質の定量的存在を特定するだけではありません。実際、NET に似た構造を具体的に検出できるという利点があります。NETでは、上記のタンパク質は細胞外DNAと共局在しており、染色された各タンパク質と細胞外DNAの蛍光シグナルの重なりによって検出できます。NETでは細胞外DNAとタンパク質の共局在によるシグナルの重複とは対照的に、無傷の好中球は共局在を示しません。ここで、NET成分は、通常、顆粒、核、および細胞質³に別々に貯蔵される。

最初の発見以来、NETは多くの疾患、特に炎症を伴う疾患において中心的な役割を果たしていることが示されています。NETは、血液や組織中の細胞外病原体を捕捉して死滅させることで、感染時....

プロトコル

この研究には、ドイツ、ハンブルクのハンブルク州動物研究局(Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)によって承認された実験に由来するマウス組織が含まれていました(73/17、100/17、94/16、109/2018、63/16)。使用した組織は、敗血症モデルからのマウスの肺と結腸、および火傷した皮膚でした。8週齢の雄と雌のマウスを使用しました。科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63 / EUは、すべての実験で従いました。匿名化されたヒトサンプルには、新生児腸炎、火傷した皮膚、胆道閉鎖症、脊椎椎間板炎、および心筋の組織が含まれていました。ハンブルクの医学研究倫理委員会によると、サンプルはインフォームドコンセントを必要としませんでしたが、研究は委員会によって承認されました(WF-026 / 21)。

1. サンプル固定

1. サンプルの固定、脱水、パラフィン包埋、切片化^{、およびマウント}には、Abu AbedおよびBrinkmannに由来する次のプロトコルを使用します^3,15。
   1. 40 gのパラホルムアルデヒド(PFA)を800 mLのトリス緩衝生理食塩水(pH 7.4(TBS))に溶解して、4%ホルムアルデヒド溶液を調製します。
   ....

ディスカッション

この研究では、NETをイメージングするための既存のプロトコルを、実際の染色プロセスから始めて、より多くの組織タイプに適応させ、最適化することを目指しました。この方法の最初の重要なステップは、最適な抗体の選択です。NEについては、ヒト組織上のマウス宿主由来のNE抗体を試しましたが、ウサギ宿主由来のNEと比較して信頼性の高い染色は示されませんでした。さらに、Thålinら.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M