人和小鼠组织中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光成像

摘要

中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 与多种疾病有关，免疫荧光通常用于其可视化。然而，有各种染色方案，在许多情况下，只检查一种类型的组织。在这里，我们建立了一种普遍适用的方案，用于在小鼠和人体组织中染色NET。

摘要

中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 由中性粒细胞释放，作为对细菌感染或创伤性组织损伤的反应，但也在自身免疫性疾病和无菌性炎症中发挥作用。它们是由双链 DNA 细丝、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构。一旦释放，NETs可以捕获并杀死血液和组织中的细胞外病原体。此外，NET通过刺激血小板粘附和凝血来参与稳态调节。然而，神经内分泌失调的产生也与各种疾病有关，包括败血症或自身免疫性疾病，这使它们成为治疗干预的有希望的靶点。除电子显微镜外，使用免疫荧光成像可视化NET是目前唯一已知的证明组织中NET相互作用的方法之一。因此，已经使用了各种染色方法来可视化 NET。在文献中，描述了不同的染色方案，我们确定了方案之间显示出高度变异性的四个关键组成部分：（1）使用的抗体类型，（2）自发荧光还原剂的使用，（3）抗原修复方法，以及（4）透化。因此，在这项工作中系统地调整和改进 了体外 免疫荧光染色方案，使其适用于不同的物种（小鼠、人类）和组织（皮肤、肠道、肺、肝脏、心脏、椎间盘）。固定和石蜡包埋后，将 3 μm 厚的切片安装到载玻片上。根据改良的染色方案，用髓过氧化物酶 （MPO）、瓜氨酸组蛋白 H3 （H3cit） 和中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE） 的一抗对这些样品进行染色。用二抗对载玻片进行染色，并使用宽场荧光显微镜进行检查。根据评估表对结果进行分析，并半定量记录差异。

在这里，我们提出了一种适用于不同组织的优化NET染色方案。我们使用一种新型一抗对 H3cit 进行染色，并使用自发荧光还原剂减少非特异性染色。此外，我们证明了NET染色需要恒定的高温和小心处理样品。

引言

Brinkmann 等人于 2004 年首次将中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 可视化为不同于细胞凋亡和坏死的细胞死亡途径¹。在该途径中，中性粒细胞将其解凝的染色质释放到细胞外空间，形成覆盖着先前储存在颗粒或胞质溶胶中的抗菌蛋白的大型网状结构。这些抗菌蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE）、髓过氧化物酶 （MPO） 和瓜氨酸组蛋白 H3 （H3cit），它们通常用于 NET 的间接免疫荧光检测²。该方法不仅可以鉴定这些蛋白质的定量存在;事实上，它具有专门检测类NET结构的优点。在NET中，上述蛋白质与细胞外DNA共定位，这可以通过每个染色蛋白质和细胞外DNA的荧光信号的重叠来检测。与NET中细胞外DNA和蛋白质共定位引起的重叠信号相反，完整的中性粒细胞没有共定位。在这里，NET 组分通常分别储存在颗粒、细胞核和胞质溶胶³ 中。

自首次发现以来，已经表明NET在许多疾病中起着核心作用，特别是那些涉及炎症的疾病。NETs在感染期间通过捕获和杀死血液和组织中的细胞外病原体显示出抗菌功能^4,5。然而，NET也与自身免疫性疾病和过度炎症反应有关，如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎和过敏性哮喘^6,7,....

研究方案

这项研究包括来自汉堡国家动物研究局批准的实验的小鼠组织，Behörde für Justiz und Verbraucherschutz，汉堡，德国（73/17,100/17,94/16,109/2018,63/16）。使用的组织是来自化粪池模型的小鼠肺和结肠以及烧伤的皮肤。我们使用了 8 周龄的雄性和雌性小鼠。所有实验均遵循关于保护用于科学目的的动物的欧洲指令 2010/63/EU。匿名的人类样本包括新生儿小肠结肠炎、烧伤皮肤、胆道闭锁、椎间盘炎和心肌的组织。根据汉堡医学研究伦理委员会的说法，这些样本不需要知情同意，但该研究得到了委员会的批准（WF-026/21）。

1. 样品固定

1. 使用源自 Abu Abed 和 Brinkmann 的以下方案进行样品固定、脱水、石蜡包埋、切片和封片 ^3,15。
   1. 通过将 40 g 多聚甲醛 （PFA） 溶解在 800 mL Tris 缓冲盐水 （pH 7.4） （TBS） 中来制备 4% 甲醛溶液。
   2. 在通风橱下在60°C下搅拌混合物，直到PFA溶解。将溶液置于室温 （RT），并用 TBS 将体积调节至 1,000 mL。
   3. 将pH值调节至7.4。在4°C下储存2-3周或在-20°C下储存长达1年。

讨论

在这项工作中，我们旨在从实际染色过程开始，调整和优化现有的NET成像方案，以适应更多的组织类型。该方法的第一个关键步骤是选择最合适的抗体。对于NE，我们在人体组织上尝试了来自小鼠宿主的NE抗体，与来自兔宿主的NE相比，该抗体没有显示出可靠的染色。此外，Thålin 等人提出 H3cit （R8） 作为细胞外染色的更具特异性的抗体。我们将该抗体与广泛使用的triH3cit（R2，R8，R17）进行了比较?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M