Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden von Neutrophilen als Reaktion auf bakterielle Infektionen oder traumatische Gewebeschäden freigesetzt, spielen aber auch eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen und sterilen Entzündungen. Es handelt sich um netzartige Strukturen, die aus doppelsträngigen DNA-Filamenten, Histone und antimikrobiellen Proteinen bestehen. Einmal freigesetzt, können NETs extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten. Darüber hinaus sind NETs an der homöostatischen Regulation beteiligt, indem sie die Adhäsion und Koagulation von Blutplättchen stimulieren. Die dysregulierte Produktion von NETs wurde jedoch auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Sepsis oder Autoimmunerkrankungen, was sie zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Interventionen macht. Neben der Elektronenmikroskopie ist die Visualisierung von NETs mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung derzeit eine der wenigen bekannten Methoden, um NET-Wechselwirkungen im Gewebe nachzuweisen. Daher wurden verschiedene Färbemethoden zur Visualisierung von NETs eingesetzt. In der Literatur werden verschiedene Färbeprotokolle beschrieben, und wir haben vier Schlüsselkomponenten identifiziert, die eine hohe Variabilität zwischen den Protokollen aufweisen: (1) die Art der verwendeten Antikörper, (2) die Verwendung von Autofluoreszenz-reduzierenden Mitteln, (3) Antigen-Retrieval-Methoden und (4) Permeabilisierung. Daher wurden in dieser Arbeit in vitro Immunfluoreszenz-Färbeprotokolle systemisch angepasst und verbessert, um sie für verschiedene Spezies (Maus, Mensch) und Gewebe (Haut, Darm, Lunge, Leber, Herz, Bandscheibe) anwendbar zu machen. Nach der Fixierung und Paraffineinbettung wurden 3 μm dicke Schnitte auf Objektträger montiert. Diese Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO), citrulliniertes Histon H3 (H3cit) und neutrophile Elastase (NE) nach einem modifizierten Färbeprotokoll gefärbt. Die Objektträger wurden mit Sekundärantikörpern gefärbt und mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse wurden anhand eines Bewertungsbogens analysiert und Unterschiede semi-quantitativ erfasst.

Hier stellen wir ein optimiertes NET-Färbeprotokoll vor, das für verschiedene Gewebe geeignet ist. Wir verwendeten einen neuartigen Primärantikörper zur Färbung von H3cit und reduzierten die unspezifische Färbung mit einem Autofluoreszenz-reduzierenden Mittel. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NET-Färbung eine konstant hohe Temperatur und einen sorgfältigen Umgang mit den Proben erfordert.

Einleitung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) wurden erstmals 2004 von Brinkmann et al. als ein Weg des Zelltods visualisiert, der sich von Apoptose und Nekrose unterscheidet¹. Auf diesem Weg geben Neutrophile ihr dekondensiertes Chromatin in den extrazellulären Raum ab, um große netzartige Strukturen zu bilden, die mit antimikrobiellen Proteinen bedeckt sind, die zuvor in den Granula oder dem Zytosol gespeichert waren. Zu diesen antimikrobiellen Proteinen gehören neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO) und citrulliniertes Histon H3 (H3cit), die üblicherweise für den indirekten Immunfluoreszenznachweis von NETs^{verwendet werden 2}. Diese Methode identifiziert nicht nur das quantitative Vorhandensein dieser Proteine; in der Tat hat es den Vorteil, NET-ähnliche Strukturen spezifisch zu detektieren. In den NETs kolokalisieren die genannten Proteine mit extrazellulärer DNA, was durch eine Überlappung der Fluoreszenzsignale jedes gefärbten Proteins und der extrazellulären DNA nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zu den überlappenden Signalen, die auf die Kolokalisation von extrazellulärer DNA und Proteinen in NETs zurückzuführen sind, zeigen intakte Neutrophile keine Kolokalisation. Hier werden die NET-Komponenten in der Regel getrennt in den Granula, Zellkernen und Zytosol³ gelagert.

Seit ihrer ersten Entdeckung hat sich gezeigt, dass NETs bei zahlreichen Krankheiten, insbesondere bei Entzündungen, eine zentrale Rolle spielen. NETs zeigen antimikrobielle Funktionen während der Infektion, indem sie extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten ^4,5. NETs wurden jedoch auch mit Autoimmunerkrankungen und hyperinflammatorischen Reaktionen wie systemischem Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis und allergischem Asthma in Verbindung gebracht ^6,7,8. NETs fördern Vaso-Verschluss und Entzündung bei Atherosklerose, Thrombozytenadhäsion und es wird spekuliert, dass sie eine Rolle bei metastasierendem Krebs spielen 9,10,11. Dennoch wird angenommen, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften haben, indem sie den proinflammatorischen Zytokinspiegel senken¹². Während NETs in einem breiteren Forschungsfeld immer mehr an Interesse gewinnen, ist eine robuste NET-Detektionsmethode für die zukünftige Forschung von grundlegender Bedeutung.

Auch wenn die Visualisierung von NETs in verschiedenen Geweben mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung komplex ist und angepasst werden muss, ist sie neben der Elektronenmikroskopie derzeit eine der renommiertesten Methoden zur Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen NETs und Zellen und wird überwiegend in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben (FFPE) ^{eingesetzt13,14}. Der Vergleich der NET-Bildgebung ist jedoch schwierig, da verschiedene Labore ihre eigenen maßgeschneiderten Protokolle verwenden. Diese Protokolle unterscheiden sich in der Verwendung von Antikörpern, der Antigengewinnung oder der Permeabilisierungsmethode und sind oft für einen bestimmten Gewebetyp optimiert 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Nachdem Brinkmann et al. die erste methodische Studie mit immunfluoreszierender Visualisierung von NETs in FFPE-Gewebe veröffentlicht hatten, wollten wir dieses Protokoll für eine größere Vielfalt von Geweben und Spezies optimieren¹⁵. Um ein breit anwendbares Immunfluoreszenzprotokoll zu etablieren, testeten wir verschiedene modifizierte Protokolle aus Studien, die Immunfluoreszenzmethoden in FFPE-Gewebe zum Nachweis von NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 ^{verwendeten. 26,27}. Darüber hinaus haben wir einen neuen H3cit-Antikörper für eine spezifischere extrazelluläre Färbung ausprobiert²⁸. Wir stellen die Hypothese auf, dass durch die systematische Anpassung aktueller Färbeprotokolle an verschiedene Spezies und Gewebe die In-vitro-Bildgebung verbessert werden kann, was zu einer besseren Darstellung der Interaktion zwischen Neutrophilen und NETs sowohl lokal als auch systemisch führt.

Protokoll

Diese Studie umfasste Mausgewebe aus Experimenten, die von der Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, genehmigt wurden (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Bei den verwendeten Geweben handelte es sich um Maus, Lunge und Dickdarm aus einem septischen Modell und verbrannte Haut. Wir haben 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet. Bei allen Versuchen wurde die europäische Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere befolgt. Die anonymisierten menschlichen Proben umfassten Gewebe von neonataler Enterokolitis, verbrannter Haut, Gallengangsatresie, Spondylodiszitis und Myokard. Nach Angaben der Ethikkommission für medizinische Forschung Hamburg bedurften die Proben keiner Einverständniserklärung, die Studie wurde jedoch von der Kommission genehmigt (WF-026/21).

1. Proben-Fixierung

1. Verwenden Sie das folgende Protokoll, das von Abu Abed und Brinkmann abgeleitet wurde, für die Probenfixierung, Dehydratisierung, Paraffineinbettung, Schnitte und Einbettung ^3,15.
   1. Bereiten Sie eine 4%ige Formaldehydlösung vor, indem Sie 40 g Paraformaldehyd (PFA) in 800 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (TBS) auflösen.
   2. Die Mischung bei 60 °C unter einem Abzug rühren, bis sich das PFA aufgelöst hat. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (RT) und stellen Sie das Volumen mit TBS auf 1.000 ml ein.
   3. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. 2-3 Wochen bei 4 °C oder bis zu 1 Jahr bei −20 °C lagern.
2. Zur Fixierung der Probe wird frisches Gewebe in TBS-Puffer gelegt und in Stücke zerlegt, die kleiner als 20 mm x 30 mm x 3 mm sind. Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 12-24 h in 4%ige Paraformaldehydlösung.
   HINWEIS: Das ursprüngliche Protokoll verwendete eine 2%ige PFA-Lösung und eine Fixierungszeit von 8-20 Stunden. Mit dieser Methode waren einige Gewebeschnitte nach 20 h nicht vollständig fixiert, so dass die PFA-Konzentration auf 4% PFA erhöht wurde.
3. Überführen Sie die Proben in beschriftete Tissue-Processing-Kassetten. Verwenden Sie lösungsmittelbeständige Marker oder Bleistifte für die Beschriftung.
4. Beginnen Sie mit der Dehydrierung der Probe, indem Sie die Kassetten 1 h lang in 70%iges Ethanol tauchen. Dann in 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, 96 % Ethanol und zweimal in 100 % Ethanol eintauchen, wobei jeder Schritt 1 Stunde dauert.
5. Zweimal in 100%iges Xylol (Dimethylbenzol) und dann zweimal für jeweils 1 h in 60 °C Paraffin eintauchen.
6. Verwenden Sie Einbettformen für die Montage und lassen Sie das Paraffin erstarren, bevor Sie die Form entfernen.
7. Verwenden Sie ein Mikrotom zum Schneiden von 3 μm dicken Gewebeschnitten.
8. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte mit einer Pinzette in ein 37 °C warmes Wasserbad und lassen Sie sie auf der Oberfläche schwimmen, um die Gewebeschnitte zu dehnen.
9. Legen Sie die Abschnitte auf selbstklebende Objektträger (Materialtabelle) und lassen Sie sie über Nacht in einer 40 °C heißen Wärmekammer trocknen.

2. Rehydrierung der Probe

1. Zur Entparaffinierung werden die Objektträger in einem Objektträgergestell gestapelt und zweimal für jeweils 5 Minuten in das Xylol-Ersatzmedium Limonen (Materialtabelle) und einmal für 5 Minuten in ein 1:1-Limonen/Ethanol-Gemisch getaucht.
   ACHTUNG: Limonen ist bei 50 °C brennbar und kann allergische Reaktionen hervorrufen. Unter einem Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden. Von offenem Feuer fernhalten.
2. Rehydrieren Sie die Proben in einer absteigenden Ethanolreihe, indem Sie das Objektträgergestell zweimal in 100 % Ethanol und einmal in 96 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol für jeweils 5 Minuten eintauchen.
3. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in deionisiertes Wasser (DI-Wasser), um das restliche Ethanol zu entfernen.

3. Autofluoreszenz-Blockierung und Antigen-Rückgewinnung

1. pH 6 Citrat Target Retrieval Solution (TRS) (Table of Materials) gemäß dem Datenblatt vorbereiten. Dieses TRS ist 10-fach konzentriert. Daher 1:10 mit DI-Wasser verdünnen. In einem Färbeglas aus Kunststoff auf 96 °C vorheizen.
   HINWEIS: TRS bricht die Methylenbrücken, die während der Probenfixierung gebildet werden, um die Antigenepitope freizulegen. Dadurch können die Primärantikörper an ihr Zielantigen binden. Konzentriertes TRS 8 Monate lang bei 2-8 °C lagern. Bereiten Sie immer frisches TRS zu.
2. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Objektträgergestell und legen Sie sie in eine feuchte Kammer. Pipettieren Sie ein bis zwei Tropfen Autofluoreszenzreduktionsmittel (Materialtabelle) auf jede Probe. 5 Minuten inkubieren.
   HINWEIS: Das Autofluoreszenzreduktionsmittel blockiert die inhärente Autofluoreszenz des Gewebes, die durch endogene Fluorophore und Fixiermittel verursacht wird. Lagern Sie das Autofluoreszenz-Reduktionsmittel bis zu 1 Jahr bei RT.
   HINWEIS: Arbeiten Sie nur mit kleinen Gewebeabschnitten, um ein Austrocknen der Proben oder eine Überschreitung der Inkubationszeit zu vermeiden.
3. Stapeln Sie die Objektträger wieder in das Objektträgergestell und spülen Sie sie 1 Minute lang in 60%igem Ethanol mit einer Aufwärts- und Abwärtsbewegung, bis das gesamte unbenutzte Autofluoreszenz-reduzierende Reagenz abgewaschen ist.
4. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in DI-Wasser.
5. Für die Antigengewinnung werden die Objektträger mit dem vorgewärmten TRS in ein Färbegefäß gegeben. 10 min bei 96 °C im Wasserbad inkubieren.
   HINWEIS: Das 96 °C warme Wasserbad kann durch eine Mikrowelle oder einen Dampfgarer ersetzt werden, wenn der TRS auf 96 °C vorgeheizt ist und eine Inkubationszeit von 10 Minuten bei 96 °C gewährleistet ist.
6. Nehmen Sie das Färbeglas heraus und lassen Sie es ca. 60-90 Minuten lang langsam auf RT abkühlen.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 4 Stunden pausiert werden, wobei die Folien im TRS verbleiben.
7. Entferne die TRS, aber bewahre die Objektträger im Glas auf. Zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween (TBST, pH 7,4) jeweils 3 Minuten lang spülen, um alle übrig gebliebenen TRS-Rückstände abzuwaschen.
8. Für die Permeabilisierung wird 0,2 % Triton in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt und in das Färbegefäß gefüllt, um die Proben 10 Minuten lang zu permeabilisieren.
   HINWEIS: Die Permeabilisierung verbessert die Bindung der primären Antikörper an die intrazellulären Zielproteine in den fixierten Proben.
9. Spülen Sie die Objektträger erneut zweimal in TBST für jeweils 3 min.
10. Bereiten Sie die Nasskammer vor und legen Sie die Objektträger aus. Wischen Sie überschüssiges Wasser mit Papiertaschentüchern von den Objektträgern ab. Umkreisen Sie jede Probe mit einem hydrophoben Barrierestift, um zu verhindern, dass die Antikörperlösung abläuft.
    HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Am besten ist es, mit kleinen Abschnitten zu arbeiten.

4. Blockierung der unspezifischen Antikörperbindung

1. Nehmen Sie gebrauchsfertige Blockierungslösung mit Eselsserum (Materialtabelle) und pipettieren Sie einen Tropfen auf jede Probe. 30 Minuten bei RT inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Blockierungsschritt minimiert die Bindung des sekundären Antikörpers an unspezifische Bindungsstellen auf der Probe. Nach der Blockierung dieser unspezifischen Epitope und dem Auftragen des Primärantikörpers bindet der Sekundärantikörper an den Primärantikörper und interagiert nicht mit der Oberfläche des Gewebes. Dieses gebrauchsfertige Blockierungsreagenz wird 6 Monate lang bei 2-8 °C gelagert.
2. Entfernen Sie überschüssige Blockierungslösung von Objektträgern, indem Sie die Kante der Objektträger gegen eine harte Oberfläche klopfen. Spülen Sie sie nicht aus.

5. Primärer Antikörper

1. Primärantikörper im Antikörperverdünnungspuffer verdünnen (Materialtabelle). Verwenden Sie für jede Probe ca. 100 μl der endgültigen Lösung. Für den NE- und H3cit-Antikörper (R8) und die Isokontrolle auf eine Konzentration von 5 μg/ml verdünnen. Für MPO und die entsprechende Isokontrolle verwenden Sie 10 μg/ml. Bereiten Sie ein Röhrchen für jeden Primärantikörper und eines für jeden Isocontrol-Antikörper vor.
   HINWEIS: H3cit (R8)/MPO oder NE/MPO und ihre Isokontrollen können für die NET-Färbung kombiniert werden. Für die Kombination von H3cit (R8)/MPO wird auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für H3cit (R8) und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnt. Bei NE/MPO auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für NE und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnen. Verwenden Sie für die Isokontrolle die gleiche Konzentration wie für jeden entsprechenden Antikörper. Verwenden Sie für jeden verwendeten Antikörper immer eine neue Pipettenspitze. Primärantikörper können bei 4 °C für 1-2 Wochen und bei −20 °C oder −80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.
2. Verwenden Sie mit zwei Proben auf einem Objektträger eine für die Isocontrol-Antikörper und eine für die MPO/H3cit- oder MPO/NE-Antikörperverdünnung. Verwenden Sie ca. 100 μl für jede Probe und verteilen Sie die Antikörperlösung gleichmäßig.
   HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Achten Sie darauf, dass Sie die Isokontroll- und Primärantikörper nicht verwechseln.
3. Über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4 °C lagern.
4. Klopfen Sie am nächsten Tag die überschüssige Primärantikörperlösung von den Objektträgern ab und stapeln Sie die Objektträger in einer Küvette. Dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST spülen, um die verbleibende Primärantikörperlösung abzuwaschen.

6. Sekundärer Antikörper

1. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor. Verwenden Sie zwei verschiedene fluoreszierende Sekundärantikörper: Esel-Anti-Ziege für MPO und Esel-Anti-Kaninchen für die H3cit-Färbung. Verdünnen Sie sie jeweils auf eine Konzentration von 7,5 μg/ml mit Antikörper-Verdünnungspuffer (Materialtabelle).
   HINWEIS: Verwenden Sie für die Doppelfärbung zwei fluoreszierende Antikörper mit unterschiedlichen Anregungsbereichen und minimaler spektraler Überlappung. Kombinieren Sie beide Sekundärantikörper und verdünnen Sie sie auf eine Endkonzentration von 7,5 μg/ml für jeden Antikörper, um ein Endvolumen von 100 μl pro Probe zu erhalten. Schützen Sie die Antikörper vor Licht. Die Sekundärantikörper können bei 2-8 °C für 6-8 Wochen oder bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.
2. Bewahren Sie die Objektträger in der Nasskammer auf und geben Sie 100 μl der Sekundärantikörperlösung auf jede Probe. Lassen Sie sie 30 Minuten bei RT und lichtgeschützt inkubieren.
3. Klopfen Sie die überschüssige Sekundärantikörperlösung ab und stapeln Sie die Objektträger im Objektträgergestell. Dreimal für jeweils 5 Minuten in ein mit PBS gefülltes Färbegefäß eintauchen, um alle verbleibenden ungebundenen Antikörper abzuwaschen.
4. Bereiten Sie die DAPI-Lösung (4',6-Diamidino-2-phenylindol) (Materialtabelle) vor und verdünnen Sie sie mit DI-Wasser auf eine Konzentration von 1 μg/ml. Tauchen Sie das Objektträgergestell in ein Färbegefäß mit DAPI-Lösung und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
   HINWEIS: DAPI wird als Fluoreszenzfärbung für doppelsträngige DNA verwendet. Die vorbereitete DAPI-Lösung kann mehrfach verwendet werden. Bewahren Sie die vorbereitete DAPI-Lösung bei RT auf. Das DAPI-Konzentrat kann bei −20 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
5. Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in ein Färbegefäß mit PBS, um die überschüssige DAPI-Lösung abzuwaschen.

7. Montieren und Lagern der Proben, mikroskopische Analyse

1. Montieren Sie die Proben mit Deckgläsern und Eindeckmedium (Materialtabelle).
   HINWEIS: Verwenden Sie nur kleine Mengen des Eindeckmediums und wischen Sie das überschüssige Medium mit feuchten Taschentüchern ab. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie es, versehentlich Medien von den Deckgläsern oder Objektträgern abzuwischen. Vermeiden Sie Blasenbildung und drücken Sie mit Wattestäbchen vorsichtig auf die Deckgläser, um Blasen von den Objektträgern zu entfernen.
2. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Weitfeldmikroskop oder ein konfokales Mikroskop.
   HINWEIS: Machen Sie zuerst ein Bild von der Isokontrolle. Verringern Sie die Belichtungszeit für die Fluoreszenzfilter (mit Ausnahme des Blaufilters für DAPI), bis fast kein Signal mehr detektiert werden kann. Verwenden Sie dann diese Einstellung, um die entsprechenden Beispiele zu untersuchen. Suchen Sie nach Bereichen, in denen mit Hilfe des Fluoreszenzkanals ein Fluoreszenzsignal in jeder einzelnen Probe detektiert werden kann. Nach der Aufnahme eines Bildes des Bereichs erzeugt das Programm ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle und zeigt die verschiedenen Fluoreszenzsignale als Überlappung verschiedener Farben an. Das Bild kann dann für die Co-Lokalisierung mit Bildgebungssoftware wie ImageJ weiter analysiert werden.
3. Lagern Sie die Objektträger bis zu 6 Monate bei 4 °C.

Ergebnisse

Bevor wir mit unserer Protokolloptimierung begannen, identifizierten wir die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Färbung, indem wir in PubMed nach Studien suchten, die FFPE-Gewebe für die Immunfärbung von NETs verwendeten, und ihre Protokolle verglichen. Die erfolgversprechendsten Protokollunterschiede wurden als Schlüsselschritte für die Protokolloptimierung identifiziert, während Schritte, die größtenteils miteinander korrespondierten, nicht verändert wurden (Tabelle 1).

Diskussion

In dieser Arbeit zielten wir darauf ab, die bestehenden Protokolle für die Bildgebung von NETs an weitere Gewebetypen anzupassen und zu optimieren, beginnend mit dem eigentlichen Färbeprozess. Der erste kritische Schritt für diese Methode ist die Auswahl der am besten geeigneten Antikörper. Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der im Vergleich zu NE von einem Kaninchenwirt keine zuverlässige Färbung zeigte. Darüber hinaus schlugen Thålin et al. H3cit (R8) als...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M