Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son liberadas por los neutrófilos como respuesta a una infección bacteriana o daño tisular traumático, pero también desempeñan un papel en las enfermedades autoinmunes y la inflamación estéril. Son estructuras en forma de red compuestas por filamentos de ADN bicatenarios, histonas y proteínas antimicrobianas. Una vez liberados, los TNE pueden atrapar y matar patógenos extracelulares en la sangre y los tejidos. Además, los TNE participan en la regulación homeostática estimulando la adhesión plaquetaria y la coagulación. Sin embargo, la producción desregulada de TNE también se ha asociado con diversas enfermedades, como la sepsis o los trastornos autoinmunes, lo que los convierte en una diana prometedora para la intervención terapéutica. Aparte de la microscopía electrónica, la visualización de los NET mediante imágenes de inmunofluorescencia es actualmente uno de los únicos métodos conocidos para demostrar las interacciones de los NET en los tejidos. Por lo tanto, se han utilizado varios métodos de tinción para visualizar los NET. En la literatura, se describen diferentes protocolos de tinción, e identificamos cuatro componentes clave que muestran una alta variabilidad entre los protocolos: (1) los tipos de anticuerpos utilizados, (2) el uso de agentes reductores de autofluorescencia, (3) los métodos de recuperación de antígenos y (4) la permeabilización. Por lo tanto, los protocolos de tinción de inmunofluorescencia in vitro se adaptaron y mejoraron sistémicamente en este trabajo para hacerlos aplicables a diferentes especies (ratón, humano) y tejidos (piel, intestino, pulmón, hígado, corazón, disco espinal). Después de la fijación y la inclusión en parafina, se montaron secciones de 3 μm de espesor en portaobjetos. Estas muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para mieloperoxidasa (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) y elastasa de neutrófilos (NE) de acuerdo con un protocolo de tinción modificado. Los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos secundarios y se examinaron con un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Los resultados se analizaron de acuerdo con una hoja de evaluación y las diferencias se registraron de forma semicuantitativa.

Aquí, presentamos un protocolo de tinción NET optimizado adecuado para diferentes tejidos. Utilizamos un nuevo anticuerpo primario para teñir H3cit y redujimos la tinción inespecífica con un agente reductor de autofluorescencia. Además, demostramos que la tinción con NET requiere una temperatura alta constante y un manejo cuidadoso de las muestras.

Introducción

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) fueron visualizadas por primera vez por Brinkmann et al. como una vía de muerte celular diferente de la apoptosis y la necrosis en 2004¹. En esta vía, los neutrófilos liberan su cromatina descondensada en el espacio extracelular para formar grandes estructuras en forma de red cubiertas de proteínas antimicrobianas que antes se almacenaban en los gránulos o en el citosol. Estas proteínas antimicrobianas incluyen la elastasa de neutrófilos (NE), la mieloperoxidasa (MPO) y la histona citrulinada H3 (H3cit), que se utilizan comúnmente para la detección indirecta por inmunofluorescencia de los TNE

Protocolo

Este estudio incluyó tejidos de ratón derivados de experimentos aprobados por la Administración Estatal de Investigación Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Los tejidos utilizados fueron pulmón y colon de ratón de un modelo séptico y piel quemada. Se utilizaron ratones machos y hembras de 8 semanas de edad. En todos los experimentos se siguió la Directiva Europea 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Las muestras humanas anonimizadas incluyeron tejidos de enterocolitis neonatal, piel quemada, atresia biliar, espondilodiscitis y miocard....

Discusión

En este trabajo, nuestro objetivo era adaptar y optimizar los protocolos existentes para la obtención de imágenes de TNE a más tipos de tejidos, comenzando con el proceso de tinción real. El primer paso crítico para este método es la selección de los anticuerpos más adecuados. Para la NE, probamos un anticuerpo de NE de un huésped de ratón en tejido humano, que no mostró una tinción confiable en comparación con la NE de un huésped de conejo. Además, Thålin et al. propusieron H3cit (R8) como un anticuerpo .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M