Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son liberadas por los neutrófilos como respuesta a una infección bacteriana o daño tisular traumático, pero también desempeñan un papel en las enfermedades autoinmunes y la inflamación estéril. Son estructuras en forma de red compuestas por filamentos de ADN bicatenarios, histonas y proteínas antimicrobianas. Una vez liberados, los TNE pueden atrapar y matar patógenos extracelulares en la sangre y los tejidos. Además, los TNE participan en la regulación homeostática estimulando la adhesión plaquetaria y la coagulación. Sin embargo, la producción desregulada de TNE también se ha asociado con diversas enfermedades, como la sepsis o los trastornos autoinmunes, lo que los convierte en una diana prometedora para la intervención terapéutica. Aparte de la microscopía electrónica, la visualización de los NET mediante imágenes de inmunofluorescencia es actualmente uno de los únicos métodos conocidos para demostrar las interacciones de los NET en los tejidos. Por lo tanto, se han utilizado varios métodos de tinción para visualizar los NET. En la literatura, se describen diferentes protocolos de tinción, e identificamos cuatro componentes clave que muestran una alta variabilidad entre los protocolos: (1) los tipos de anticuerpos utilizados, (2) el uso de agentes reductores de autofluorescencia, (3) los métodos de recuperación de antígenos y (4) la permeabilización. Por lo tanto, los protocolos de tinción de inmunofluorescencia in vitro se adaptaron y mejoraron sistémicamente en este trabajo para hacerlos aplicables a diferentes especies (ratón, humano) y tejidos (piel, intestino, pulmón, hígado, corazón, disco espinal). Después de la fijación y la inclusión en parafina, se montaron secciones de 3 μm de espesor en portaobjetos. Estas muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para mieloperoxidasa (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) y elastasa de neutrófilos (NE) de acuerdo con un protocolo de tinción modificado. Los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos secundarios y se examinaron con un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Los resultados se analizaron de acuerdo con una hoja de evaluación y las diferencias se registraron de forma semicuantitativa.

Aquí, presentamos un protocolo de tinción NET optimizado adecuado para diferentes tejidos. Utilizamos un nuevo anticuerpo primario para teñir H3cit y redujimos la tinción inespecífica con un agente reductor de autofluorescencia. Además, demostramos que la tinción con NET requiere una temperatura alta constante y un manejo cuidadoso de las muestras.

Introducción

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) fueron visualizadas por primera vez por Brinkmann et al. como una vía de muerte celular diferente de la apoptosis y la necrosis en 2004¹. En esta vía, los neutrófilos liberan su cromatina descondensada en el espacio extracelular para formar grandes estructuras en forma de red cubiertas de proteínas antimicrobianas que antes se almacenaban en los gránulos o en el citosol. Estas proteínas antimicrobianas incluyen la elastasa de neutrófilos (NE), la mieloperoxidasa (MPO) y la histona citrulinada H3 (H3cit), que se utilizan comúnmente para la detección indirecta por inmunofluorescencia de los TNE². Este método no solo identifica la presencia cuantitativa de estas proteínas; de hecho, tiene la ventaja de detectar específicamente estructuras similares a NET. En los NETs, las proteínas mencionadas se colocalizan con el ADN extracelular, que puede ser detectado por una superposición de las señales de fluorescencia de cada proteína teñida y el ADN extracelular. A diferencia de las señales superpuestas debidas a la colocalización extracelular de ADN y proteínas en los TNE, los neutrófilos intactos no muestran colocalización. Aquí, los componentes del NET generalmente se almacenan por separado en los gránulos, los núcleos y el citosol³.

Desde su primer descubrimiento, se ha demostrado que los TNE desempeñan un papel central en numerosas enfermedades, especialmente en las que implican inflamación. Los TNE muestran funciones antimicrobianas durante la infección al atrapar y matar patógenos extracelulares en sangre y tejidos ^4,5. Sin embargo, los TNE también se han relacionado con enfermedades autoinmunes y respuestas hiperinflamatorias, como el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumática y el asma alérgica ^6,7,8. Los TNE promueven la vaso-oclusión y la inflamación en la aterosclerosis, la adhesión plaquetaria y se especula que desempeñan un papel en el cáncer metastásico 9,10,11. Sin embargo, se cree que tienen propiedades antiinflamatorias al reducir los niveles de citoquinas proinflamatorias¹². Si bien los NET están ganando más interés en un campo de investigación más amplio, un método robusto de detección de NET es fundamental para futuras investigaciones.

A pesar de que la visualización de los TNE en diferentes tejidos mediante imágenes de inmunofluorescencia es compleja y requiere personalización, además de la microscopía electrónica, actualmente es uno de los métodos más reconocidos para visualizar las interacciones entre los TNE y las células y se utiliza predominantemente en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE)^13,14. Sin embargo, la comparación de las imágenes NET es difícil, ya que los diferentes laboratorios utilizan sus propios protocolos personalizados. Estos protocolos difieren en el uso de anticuerpos, la recuperación de antígenos o el método de permeabilización y, a menudo, están optimizados para un tipo específico de tejido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Después de que Brinkmann et al. publicaran el primer estudio metódico utilizando la visualización inmunofluorescente de NETs en tejido FFPE, quisimos optimizar este protocolo para una variedad más amplia de tejidos y especies¹⁵. Además, para establecer un protocolo de inmunofluorescencia ampliamente aplicable, probamos diferentes protocolos modificados de estudios que utilizaron métodos de inmunofluorescencia en tejido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Además, probamos un nuevo anticuerpo H3cit para una tinción extracelular más específica²⁸. Nuestra hipótesis es que mediante la adaptación sistemática de los protocolos de tinción actuales a diferentes especies y tejidos, se pueden mejorar las imágenes in vitro, lo que resulta en una mejor representación de la interacción entre los neutrófilos y los NET tanto a nivel local como sistémico.

Protocolo

Este estudio incluyó tejidos de ratón derivados de experimentos aprobados por la Administración Estatal de Investigación Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Los tejidos utilizados fueron pulmón y colon de ratón de un modelo séptico y piel quemada. Se utilizaron ratones machos y hembras de 8 semanas de edad. En todos los experimentos se siguió la Directiva Europea 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Las muestras humanas anonimizadas incluyeron tejidos de enterocolitis neonatal, piel quemada, atresia biliar, espondilodiscitis y miocardio. Según el Comité de Ética de la Investigación Médica de Hamburgo, las muestras no necesitaron consentimiento informado, pero el estudio fue aprobado por el comité (WF-026/21).

1. Fijación de la muestra

1. Utilice el siguiente protocolo derivado de Abu Abed y Brinkmann para la fijación de muestras, la deshidratación, la inclusión en parafina, el seccionamiento y el montaje ^3,15.
   1. Prepare una solución de formaldehído al 4% disolviendo 40 g de paraformaldehído (PFA) en 800 ml de solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS).
   2. Agitar la mezcla a 60 °C bajo una campana extractora hasta que el PFA se haya disuelto. Lleve la solución a temperatura ambiente (RT) y ajuste el volumen con TBS a 1.000 ml.
   3. Ajusta el pH a 7,4. Conservar a 4 °C durante 2-3 semanas o a -20 °C durante un máximo de 1 año.
2. Para la fijación de la muestra, coloque el tejido fresco en tampón TBS y diseccione en trozos de menos de 20 mm x 30 mm x 3 mm. Sumerja las secciones de tejido en una solución de paraformaldehído al 4% durante 12-24 h.
   NOTA: El protocolo original utilizaba una solución de PFA al 2% y un tiempo de fijación de 8-20 h. Con este método, algunas secciones de tejido no se fijaron completamente después de 20 h, por lo que la concentración de PFA se incrementó al 4% de PFA.
3. Transfiera las muestras a casetes de procesamiento de tejidos etiquetados. Use marcadores o lápices resistentes a solventes para etiquetar.
4. Inicie la deshidratación de la muestra sumergiendo los casetes en etanol al 70% durante 1 h. Luego, sumérjalo en etanol al 80%, etanol al 90%, etanol al 96% y dos veces en etanol al 100%, con una duración de 1 h en cada paso.
5. Sumergir dos veces en xileno al 100% (dimetilbenceno) y luego dos veces en parafina a 60 °C durante 1 h cada vez.
6. Use moldes de inclusión para el montaje y deje que la parafina se solidifique antes de quitar el molde.
7. Utilice un micrótomo para cortar secciones de tejido de 3 μm de grosor.
8. Utilice unas pinzas para colocar las secciones cortadas en un baño de agua a 37 °C y déjelas flotar en la superficie para estirar los cortes de tejido.
9. Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio adhesivo (Tabla de materiales) y déjelas secar durante la noche en una cámara de calor a 40 ° C.

2. Rehidratación de la muestra

1. Para la desparafinación, apile los portaobjetos en una rejilla de portaobjetos y sumérjalos dos veces durante 5 minutos cada uno en el medio de reemplazo de xileno limoneno (Tabla de materiales) y una vez durante 5 minutos en una mezcla 1:1 de limoneno / etanol.
   PRECAUCIÓN: El limoneno es inflamable a 50 °C y puede causar reacciones alérgicas. Úselo debajo de una campana extractora con protección para los ojos y guantes. Manténgase alejado del fuego abierto.
2. Rehidrate las muestras en una serie descendente de etanol sumergiendo la rejilla de portaobjetos dos veces en etanol al 100 % y una vez en etanol al 96 %, al 90 % de etanol, al 80 % de etanol y al 70 % de etanol durante 5 minutos cada una.
3. Sumerja la rejilla de portaobjetos durante 5 minutos en agua desionizada (agua desionizada) para limpiar cualquier resto de etanol.

3. Bloqueo de autofluorescencia y recuperación de antígenos

1. Prepare la solución de recuperación de citrato de pH 6 (TRS) (Tabla de materiales) de acuerdo con la hoja de datos. Este TRS se concentra 10 veces. Por lo tanto, diluya 1:10 con agua desionizada. Precalentar en un tarro de plástico a 96 °C.
   NOTA: TRS rompe los puentes de metileno formados durante la fijación de la muestra para exponer los epítopos del antígeno. Esto permite que los anticuerpos primarios se unan a su antígeno diana. Almacenar TRS concentrado a 2-8 °C durante 8 meses. Siempre prepare TRS fresco.
2. Saque los portaobjetos de la rejilla de portaobjetos y colóquelos en una cámara húmeda. Pipetear una o dos gotas de agente reductor de autofluorescencia (Tabla de materiales) en cada muestra. Incubar durante 5 min.
   NOTA: El agente reductor de autofluorescencia bloquea la autofluorescencia tisular inherente causada por fluoróforos y fijadores endógenos. Almacene el agente reductor de autofluorescencia en RT hasta por 1 año.
   NOTA: Trabaje solo con pequeñas secciones de tejidos para evitar que las muestras se sequen o excedan el tiempo de incubación.
3. Vuelva a apilar los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y enjuague durante 1 minuto con etanol al 60 % con un movimiento hacia arriba y hacia abajo hasta que se haya eliminado todo el reactivo reductor de autofluorescencia no utilizado.
4. Sumerja la rejilla deslizante durante 5 minutos en agua desionizada.
5. Para la recuperación de antígenos, transfiera los portaobjetos a un frasco de tinción con el TRS precalentado. Incubar durante 10 min a 96 °C en un baño maría.
   NOTA: El baño de agua a 96 °C se puede sustituir por un microondas o una cocina de vapor si el TRS se precalienta a 96 °C y se garantizan 10 minutos de tiempo de incubación a 96 °C.
6. Saque el frasco de tinción y déjelo enfriar lentamente a RT durante aproximadamente 60-90 minutos.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí hasta por 4 h, dejando las diapositivas en el TRS.
7. Retire el TRS, pero mantenga los portaobjetos en el frasco. Enjuague dos veces con solución salina tamponada con Tris con 0.05% de Tween (TBST, pH 7.4) durante 3 minutos cada una para eliminar cualquier residuo de TRS sobrante.
8. Para la permeabilización, prepare Triton al 0,2 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, y llénelo en el frasco de tinción para permeabilizar las muestras durante 10 min.
   NOTA: La permeabilización mejora la unión de los anticuerpos primarios con las proteínas diana intracelulares en las muestras fijas.
9. Enjuague los portaobjetos nuevamente dos veces en TBST durante 3 minutos cada vez.
10. Prepare la cámara húmeda y coloque los portaobjetos. Limpie el exceso de agua de los portaobjetos con pañuelos de papel. Encierre cada muestra en un círculo con una pluma de barrera hidrofóbica para evitar que la solución de anticuerpos se escurra.
    NOTA: No deje que las muestras se sequen. Lo mejor es trabajar con secciones pequeñas.

4. Bloqueo de la unión de anticuerpos inespecíficos

1. Tome una solución de bloqueo lista para usar con suero de burro (Tabla de materiales) y pipetee una gota en cada muestra. Incubar durante 30 min en RT.
   NOTA: Este paso de bloqueo minimiza la unión del anticuerpo secundario a sitios de unión no específicos en la muestra. Después de bloquear estos epítopos inespecíficos y aplicar el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario se unirá al anticuerpo primario y no interactuará con la superficie del tejido. Este reactivo de bloqueo listo para usar se almacena a 2-8 °C durante 6 meses.
2. Retire el exceso de solución de bloqueo de los portaobjetos golpeando el borde de los portaobjetos contra una superficie dura. No los enjuague.

5. Anticuerpo primario

1. Diluir los anticuerpos primarios en el tampón de dilución de anticuerpos (Tabla de materiales). Utilice aproximadamente 100 μL de la solución final para cada muestra. Para el anticuerpo NE y H3cit (R8) y el isocontrol, diluir a una concentración de 5 μg/mL. Para MPO y el isocontrol correspondiente, utilice 10 μg/mL. Prepare un tubo para cada anticuerpo primario y uno para cada anticuerpo de isocontrol.
   NOTA: H3cit (R8)/MPO o NE/MPO y sus isocontroles pueden combinarse para la tinción de NETs. Para la combinación de H3cit (R8)/MPO, diluir hasta una concentración final de 5 μg/ml para H3cit (R8) y 10 μg/ml para MPO hasta un volumen final de 100 μl por muestra. Para NE/MPO, diluir a una concentración final de 5 μg/mL para NE y 10 μg/mL para MPO a un volumen final de 100 μL por muestra. Para el isocontrol, utilice la misma concentración que para cada anticuerpo correspondiente. Utilice siempre una nueva punta de pipeta para cada anticuerpo utilizado. Los anticuerpos primarios pueden almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas y a -20 °C o -80 °C durante un máximo de 1 año.
2. Con dos muestras en un portaobjetos, utilice una para los anticuerpos de isocontrol y otra para la dilución de anticuerpos MPO/H3cit o MPO/NE. Utilice aproximadamente 100 μL para cada muestra y distribuya la solución de anticuerpos de manera uniforme.
   NOTA: No deje que las muestras se sequen. Tenga cuidado de no mezclar el isocontrol y los anticuerpos primarios.
3. Conservar en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C.
4. Al día siguiente, retira el exceso de solución de anticuerpos primarios de los portaobjetos y apila los portaobjetos en una cubeta. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez con TBST para eliminar la solución de anticuerpos primarios restante.

6. Anticuerpo secundario

1. Prepare la solución de anticuerpos secundarios. Utilice dos anticuerpos secundarios fluorescentes diferentes: burro-anti-cabra para MPO y burro-anti-conejo para la tinción de H3cit. Diluir cada uno a una concentración de 7,5 μg/mL con tampón de dilución de anticuerpos (Tabla de materiales).
   NOTA: Para la tinción doble, utilice dos anticuerpos fluorescentes con diferentes áreas de excitación y una superposición espectral mínima. Combinar ambos anticuerpos secundarios y diluir hasta una concentración final de 7,5 μg/ml para cada anticuerpo para obtener un volumen final de 100 μl por muestra. Protege los anticuerpos de la luz. Los anticuerpos secundarios pueden almacenarse a 2-8 °C durante 6-8 semanas o a -80 °C durante un máximo de 1 año.
2. Mantenga los portaobjetos en la cámara húmeda y agregue 100 μL de la solución de anticuerpos secundarios a cada muestra. Déjalos incubar durante 30 min a RT y protegidos de la luz.
3. Retire el exceso de solución de anticuerpos secundarios y apile los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos. Sumergir tres veces durante 5 minutos cada una en un frasco de tinción lleno de PBS para eliminar los anticuerpos restantes no unidos.
4. Prepare la solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Tabla de materiales) y diluya a una concentración de 1 μg/ml con agua desionizada. Sumerja la rejilla de portaobjetos en un frasco de tinción con solución DAPI e incube durante 5 minutos a RT en la oscuridad.
   NOTA: DAPI se utiliza como tinción fluorescente para ADN bicatenario. La solución DAPI preparada se puede utilizar varias veces. Guarde la solución DAPI preparada en RT. El concentrado DAPI puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año.
5. Sumerja la rejilla de portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de tinción con PBS para lavar el exceso de solución DAPI.

7. Montaje y almacenamiento de las muestras, análisis microscópico

1. Monte las muestras con cubreobjetos y medio de montaje (Tabla de materiales).
   NOTA: Utilice solo pequeñas cantidades de medio de montaje y limpie el exceso de medio con pañuelos húmedos. Use guantes y evite limpiar accidentalmente cualquier medio de los cubreobjetos o portaobjetos. Evite la formación de burbujas y use hisopos de algodón para presionar suavemente los cubreobjetos para eliminar las burbujas de los portaobjetos.
2. Para obtener imágenes, utilice un microscopio de campo amplio o un microscopio confocal.
   NOTA: Tome primero una imagen del isocontrol. Reduzca el tiempo de exposición de los filtros de fluorescencia (excepto el filtro azul para DAPI) hasta que casi no se pueda detectar ninguna señal. A continuación, utilice esta configuración para examinar las muestras correspondientes. Busque áreas donde se pueda detectar una señal fluorescente en cada muestra individual utilizando el canal de fluorescencia. Después de tomar una imagen del área, el programa genera una imagen compuesta de todos los canales y muestra las diferentes señales de fluorescencia como una superposición de diferentes colores. A continuación, la imagen se puede analizar más a fondo para su colocalización con software de imágenes como ImageJ.
3. Guarde los portaobjetos a 4 °C durante un máximo de 6 meses.

Resultados

Antes de comenzar la optimización de nuestro protocolo, identificamos los pasos clave para una tinción exitosa mediante la búsqueda en PubMed de estudios que utilizaran tejido FFPE para la inmunotinción de TNE y comparamos sus protocolos. Las diferencias de protocolo más prometedoras se identificaron como los pasos clave para la optimización del protocolo, mientras que los pasos que en su mayoría se correspondían entre sí no se modificaron (Tabla 1).

Tabla 1: ...

Discusión

En este trabajo, nuestro objetivo era adaptar y optimizar los protocolos existentes para la obtención de imágenes de TNE a más tipos de tejidos, comenzando con el proceso de tinción real. El primer paso crítico para este método es la selección de los anticuerpos más adecuados. Para la NE, probamos un anticuerpo de NE de un huésped de ratón en tejido humano, que no mostró una tinción confiable en comparación con la NE de un huésped de conejo. Además, Thålin et al. propusieron H3cit (R8) como un anticuerpo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M