Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

Abstract

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) משתחררות על ידי נויטרופילים כתגובה לזיהום חיידקי או נזק טראומטי לרקמות, אך גם ממלאות תפקיד במחלות אוטואימוניות ודלקות סטריליות. הם מבנים דמויי רשת המורכבים מחוטי דנ"א דו-גדיליים, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים. לאחר שחרורם, NETs יכולים ללכוד ולהרוג פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות. יתר על כן, NETs משתתפים בוויסות הומיאוסטטי על ידי גירוי הידבקות טסיות וקרישה. עם זאת, הייצור המווסת של NETs נקשר גם עם מחלות שונות, כולל אלח דם או הפרעות אוטואימוניות, מה שהופך אותם למטרה מבטיחה להתערבות טיפולית. מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של NETs באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא כיום אחת השיטות הידועות היחידות להדגמת אינטראקציות NET ברקמות. לכן, נעשה שימוש בשיטות צביעה שונות כדי להמחיש NETs. בספרות מתוארים פרוטוקולי צביעה שונים, וזיהינו ארבעה מרכיבים עיקריים המראים שונות גבוהה בין פרוטוקולים: (1) סוגי הנוגדנים שבהם נעשה שימוש, (2) שימוש בחומרים מפחיתי פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית, (3) שיטות שליפת אנטיגן, ו-(4) חלחול. לכן, פרוטוקולי צביעה אימונופלואורסצנטית במבחנה הותאמו ושופרו באופן מערכתי בעבודה זו כדי להפוך אותם לישימים עבור מינים שונים (עכבר, אדם) ורקמות (עור, מעי, ריאות, כבד, לב, דיסק בעמוד השדרה). לאחר קיבוע ושיבוץ פרפין, חלקים בעובי 3 מיקרומטר הותקנו על מגלשות. דגימות אלה הוכתמו בנוגדנים ראשוניים עבור myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit) ו neutrophil elastase (NE) על פי פרוטוקול צביעה שונה. השקפים הוכתמו בנוגדנים משניים ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב. התוצאות נותחו על פי דף הערכה, וההבדלים נרשמו באופן כמותי למחצה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול צביעת NET מותאם לרקמות שונות. השתמשנו בנוגדן ראשוני חדשני כדי להכתים עבור H3cit והפחתנו כתמים לא ספציפיים עם חומר להפחתת פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית. יתר על כן, הוכחנו כי צביעת רשת דורשת טמפרטורה גבוהה קבועה וטיפול זהיר בדגימות.

Introduction

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הודגמו לראשונה על ידי ברינקמן ועמיתיו כמסלול של מוות תאי שונה מאפופטוזיס ונמק בשנת 20041. במסלול זה, נויטרופילים משחררים את הכרומטין המעובה שלהם לתוך החלל החוץ-תאי כדי ליצור מבנים גדולים דמויי רשת המכוסים בחלבונים אנטי-מיקרוביאליים שהיו מאוחסנים בעבר בגרגירים או בציטוזול. חלבונים אנטי-מיקרוביאליים אלה כוללים אלסטאז נויטרופילים (NE), מיאלופרוקסידז (MPO) והיסטון ציטרוליניציה H3 (H3cit), המשמשים בדרך כלל לזיהוי עקיף של NETs2 באימונופלואורסנציה. שיטה זו לא רק מזהה את הנוכחות הכמותית של חלבונים אלה; ואכן, יש לו את היתרון של זיהוי ספציפי מבנים דמויי NET. ב-NETs, החלבונים שהוזכרו מתמקמים יחד עם דנ"א חוץ-תאי, אשר יכול להיות מזוהה על ידי חפיפה של אותות הפלואורסצנטיות של כל חלבון מוכתם והדנ"א החוץ תאי. בניגוד לאותות החופפים הנובעים מדנ"א חוץ-תאי וקולוקליזציה של חלבונים ב-NETs, נויטרופילים שלמים אינם מראים לוקליזציה משותפת. כאן, רכיבי NET מאוחסנים בדרך כלל בנפרד בגרגירים, גרעינים, וציטוזול3.

מאז גילוים הראשון, הוכח כי NETs ממלאים תפקיד מרכזי במחלות רבות, במיוחד אלה הכרוכות בדלקת. NETs מראים תפקודים אנטי-מיקרוביאליים במהלך זיהום באמצעות לכידה והרג של פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות 4,5. עם זאת, NETs נקשרו גם למחלות אוטואימוניות ולתגובות היפר-דלקתיות, כמו זאבת אדמנתית מערכתית, דלקת מפרקים שגרונית ואסתמה אלרגית 6,7,8. NETs מקדמים חסימת כלי דם ודלקת בטרשת עורקים, הידבקות טסיות, ומשערים כי הם ממלאים תפקיד בסרטן גרורתי 9,10,11. עם זאת, מאמינים שיש להם תכונות אנטי דלקתיות על-ידי הפחתת רמות הציטוקינים מעודדי דלקת12. בעוד NETs צוברים עניין רב יותר בתחום רחב יותר של מחקר, שיטת זיהוי NET חזקה היא בסיסית למחקר עתידי.

אף על פי שהדמיה של NETs ברקמות שונות באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא מורכבת ודורשת התאמה אישית, מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, היא כיום אחת השיטות הידועות ביותר להמחשת האינטראקציות בין NETs ותאים, והיא משמשת בעיקר ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE)13,14. עם זאת, השוואת הדמיה נטו קשה, שכן מעבדות שונות משתמשות בפרוטוקולים מותאמים אישית משלהן. פרוטוקולים אלה נבדלים זה מזה בשימוש שלהם בנוגדנים, בשליפת אנטיגן או בשיטת החדירה, ולעתים קרובות הם מותאמים לסוג מסוים של רקמה 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

לאחר שברינקמן ועמיתיו פרסמו את המחקר המתודי הראשון באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית של NETs ברקמת FFPE, רצינו למטב פרוטוקול זה עבור מגוון רחב יותר של רקמות ומינים15. בנוסף, כדי לבסס פרוטוקול אימונופלואורסצנטי ישים באופן רחב, בדקנו פרוטוקולים שונים ששונו ממחקרים שהשתמשו בשיטות אימונופלואורסצנטיות ברקמת FFPE כדי לזהות NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. יתר על כן, ניסינו נוגדן H3cit חדש עבור צביעה חוץ-תאית ספציפיתיותר 28. אנו משערים כי על ידי התאמה שיטתית של פרוטוקולי הצביעה הנוכחיים למינים ולרקמות שונים, ניתן לשפר את ההדמיה במבחנה, וכתוצאה מכך לייצג טוב יותר את האינטראקציה בין נויטרופילים ו- NETs הן מקומית והן מערכתית.

Protocol

מחקר זה כלל רקמות עכבר שמקורן בניסויים שאושרו על ידי המנהל הממלכתי של המבורג לחקר בעלי חיים, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, המבורג, גרמניה (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). הרקמות ששימשו היו ריאות עכברים ומעי גס ממודל ספיגה ועור שרוף. השתמשנו בעכברים זכרים ונקבות בני 8 שבועות. הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות בוצעה עבור כל הניסויים. הדגימות האנושיות האנונימיות כללו רקמות מדלקת מעיים בילוד, עור שרוף, אטרזיה של המרה, ספונדילודיסטיטיס ושריר הלב. על פי ועדת האתיקה של המחקר הרפואי של המבורג, הדגימות לא היו זקוקות להסכמה מדעת, אך המחקר אושר על ידי הוועדה (WF-026/21).

1. קיבוע לדוגמה

  1. השתמש בפרוטוקול הבא הנגזר מאבו עבד וברינקמן לקיבוע דגימה, התייבשות, הטבעה של פרפין, חתך והרכבה 3,15.
    1. הכינו תמיסת פורמלדהיד 4% על ידי המסת 40 גרם של פרפורמלדהיד (PFA) ב-800 מ"ל של מלח חוצץ טריס, pH 7.4 (TBS).
    2. ערבבו את התערובת בטמפרטורה של 60°C מתחת למכסה אדים עד שה-PFA יתמוסס. הביאו את התמיסה לטמפרטורת החדר (RT), וכווננו את עוצמת הקול עם TBS ל-1,000 מ"ל.
    3. כוונן את ה- pH ל- 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 2-3 שבועות או בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה.
  2. לקיבוע דגימה, מקם רקמה טרייה במאגר TBS וגזור לחתיכות קטנות מ- 20 מ"מ x 30 מ"מ x 3 מ"מ. לטבול את חלקי הרקמה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 12-24 שעות.
    הערה: הפרוטוקול המקורי השתמש בתמיסת PFA של 2% וזמן קיבוע של 8-20 שעות. בשיטה זו, חלק מקטעי הרקמה לא היו מקובעים לחלוטין לאחר 20 שעות, ולכן ריכוז PFA הוגדל ל 4% PFA.
  3. העבר את הדגימות לקלטות עיבוד רקמות מסומנות. השתמשו בסמנים או עפרונות עמידים בפני ממס לתיוג.
  4. התחל את התייבשות הדגימה על ידי טבילה ואז קלטות באתנול 70% למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לטבול ב-80% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול ופעמיים ב-100% אתנול, כאשר כל שלב נמשך שעה אחת.
  5. יש לטבול פעמיים ב-100% קסילן (דימתילבנזן) ולאחר מכן פעמיים בפרפין ב-60°C למשך שעה אחת בכל פעם.
  6. השתמשו בתבניות הטבעה להרכבה, ותנו לפרפין להתמצק לפני הסרת התבנית.
  7. השתמש מיקרוטום לחיתוך קטעי רקמה בעובי 3 מיקרומטר.
  8. השתמש בפינצטה כדי להניח את החלקים החתוכים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ותן להם לצוף על פני השטח כדי למתוח את חתכי הרקמות.
  9. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית דביקים (טבלה של חומרים), ותנו להם להתייבש למשך הלילה בתא חום של 40 מעלות צלזיוס.

2. התייבשות מדגם

  1. להסרת פרפיניזציה, ערמו את המגלשות במדף שקופיות, וטבלו פעמיים במשך 5 דקות כל אחת בלימונן בינוני (טבלת חומרים) עם תחליף קסילן ופעם אחת למשך 5 דקות בתערובת לימונן/אתנול ביחס 1:1.
    אזהרה: לימונן דליק ב-50°C ועלול לגרום לתגובות אלרגיות. יש להשתמש מתחת למכסה מנוע עם הגנה על העיניים וכפפות. יש להרחיק מאש גלויה.
  2. התייבשו מחדש את הדגימות בסדרת אתנול יורדת על ידי טבילת מדף השקופיות פעמיים ב-100% אתנול ופעם אחת ב-96% אתנול, 90% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול למשך 5 דקות כל אחת.
  3. יש לטבול את מדף המגלשה למשך 5 דקות במים נטולי יונים, כדי לנקות את שאריות האתנול.

3. חסימת אוטופלואורסנציה ושליפת אנטיגן

  1. הכן תמיסת אחזור מטרות ציטראט pH 6 (TRS) (טבלת חומרים) בהתאם לגליון הנתונים. TRS זה מרוכז 10 פעמים. לכן, לדלל 1:10 עם מים DI. מחממים מראש בצנצנת פלסטיק ל-96°C.
    הערה: TRS שובר את גשרי המתילן שנוצרו במהלך קיבוע הדגימה כדי לחשוף את אפיטופי האנטיגן. זה מאפשר לנוגדנים הראשוניים לקשור את אנטיגן המטרה שלהם. יש לאחסן TRS מרוכז בטמפרטורה של 2-8°C למשך 8 חודשים. הכינו תמיד TRS טרי.
  2. הוציאו את המגלשות ממדף המגלשות והניחו אותן בתא רטוב. פיפטה טיפה אחת או שתיים של חומר מקטין אוטופלואורסצנטי (טבלה של חומרים) על כל דגימה. דוגרים במשך 5 דקות.
    הערה: החומר המפחית אוטופלואורסצנטיות חוסם את האוטופלואורסצנטיות הטבועה ברקמה הנגרמת על ידי פלואורופורים וקיבועים אנדוגניים. אחסן את הסוכן המפחית פלואורסצנטיות אוטומטית ב- RT למשך עד שנה אחת.
    הערה: יש לעבוד רק עם חלקים קטנים של רקמות כדי למנוע התייבשות של הדגימות או חריגה מזמן הדגירה.
  3. ערמו את המגלשות בחזרה למדף השקופיות, ושטפו במשך דקה אחת באתנול 60% בתנועה כלפי מעלה ומטה עד שכל המגיב מפחית הפלואורסצנטיות שלא נעשה בו שימוש נשטף.
  4. טבלו את מדף המגלשה למשך 5 דקות במי DI.
  5. לשליפת אנטיגן, העבירו את המגלשות לצנצנת צביעה עם TRS שחומם מראש. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    הערה: ניתן להחליף את אמבט המים בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס במיקרוגל או בסיר אדים אם ה-TRS מחומם מראש ל-96 מעלות צלזיוס ומובטח 10 דקות של זמן דגירה ב-96 מעלות צלזיוס.
  6. הוציאו את צנצנת הכתמים החוצה, ותנו לה להתקרר באיטיות למשך כ-60-90 דקות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד 4 שעות, ולהשאיר את השקופיות ב- TRS.
  7. הסר את TRS, אך שמור את המגלשות בצנצנת. יש לשטוף פעמיים במי מלח חוצצים עם 0.05% טווין (TBST, pH 7.4) במשך 3 דקות כל אחד כדי לשטוף את שאריות TRS שנותרו.
  8. לחדירה, הכינו 0.2% טריטון במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.4, ומלאו אותו בצנצנת הצביעה כדי לחדור את הדגימות למשך 10 דקות.
    הערה: חדירות משפרת את הקישור של הנוגדנים הראשוניים עם חלבוני המטרה התוך-תאיים בדגימות הקבועות.
  9. שטפו את המגלשות שוב פעמיים ב-TBST במשך 3 דקות בכל פעם.
  10. הכינו את התא הרטוב, והניחו מגלשות. נגבו את עודפי המים משקופיות בעזרת רקמות נייר. הקף כל דגימה בעט מחסום הידרופובי כדי למנוע מתמיסת הנוגדנים לברוח.
    הערה: אין לתת לדגימות להתייבש. עדיף לעבוד עם קטעים קטנים.

4. חסימת קשירת נוגדנים לא ספציפיים

  1. קחו תמיסת חסימה מוכנה לשימוש עם נסיוב חמורים (Table of Materials), ופיפטה טיפה אחת על כל דגימה. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
    הערה: שלב חסימה זה ממזער את הקישור של הנוגדן המשני לאתרי קשירה לא ספציפיים בדגימה. לאחר חסימת אפיטופים לא ספציפיים אלה והחלת הנוגדן הראשוני, הנוגדן המשני ייקשר לנוגדן הראשוני ולא יתקשר עם פני השטח של הרקמה. מגיב חוסם מוכן לשימוש זה מאוחסן ב 2-8 ° C במשך 6 חודשים.
  2. הסר פתרון חסימת עודפים מהשקופיות על-ידי הקשה על קצה המגלשות על משטח קשיח. אין לשטוף אותם.

5. נוגדן ראשוני

  1. דילול נוגדנים ראשוניים במאגר דילול נוגדנים (טבלת חומרים). השתמש בערך 100 μL של הפתרון הסופי עבור כל דגימה. עבור נוגדן NE ו- H3cit (R8) ואיזוקונטרול, יש לדלל לריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל. עבור MPO ואיזוקונטרול תואם, השתמש ב- 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכינו צינורית אחת לכל נוגדן ראשוני וצינורית אחת לכל נוגדן איזוקונטרול.
    הערה: ניתן לשלב H3cit (R8)/MPO או NE/MPO והאיזוקונטרולים שלהם לצביעת NETs. עבור השילוב של H3cit (R8)/MPO, יש לדלל לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל עבור H3cit (R8) ו-10 מיקרוגרם/מ"ל עבור MPO לנפח סופי של 100 μL לדגימה. עבור NE/MPO, יש לדלל לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל עבור NE ו-10 מיקרוגרם/מ"ל עבור MPO לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לדגימה. עבור isocontrol, להשתמש באותו ריכוז כמו עבור כל נוגדן המתאים. השתמש תמיד בקצה פיפטה חדש עבור כל נוגדן בשימוש. נוגדנים ראשוניים ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 1-2 שבועות וב -20 ° C או -80 ° C עד 1 שנה.
  2. עם שתי דגימות בשקופית אחת, השתמש באחת עבור נוגדני איזוקונטרול ואחת עבור דילול נוגדני MPO/H3cit או MPO/NE. יש להשתמש בכ-100 מיקרוליטר לכל דגימה, ולפזר את תמיסת הנוגדנים באופן שווה.
    הערה: אין לאפשר לדגימות להתייבש. היזהר להימנע מערבוב של איזוקונטרול ונוגדנים ראשוניים.
  3. יש לאחסן בתא רטוב למשך הלילה ב-4°C.
  4. למחרת, הקש על תמיסת הנוגדנים הראשונית העודפת מהשקפים, וערם את השקופיות בקובט. יש לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם TBST כדי לשטוף את תמיסת הנוגדנים העיקרית שנותרה.

6. נוגדן משני

  1. הכן את פתרון הנוגדנים המשני. השתמש בשני נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שונים: חמור-אנטי-עז עבור MPO וחמור-אנטי-ארנב עבור צביעת H3cit. לדלל כל אחד מהם לריכוז של 7.5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות חיץ דילול נוגדנים (טבלה של חומרים).
    הערה: עבור צביעה כפולה, השתמש בשני נוגדנים פלואורסצנטיים עם אזורי עירור שונים וחפיפה ספקטרלית מינימלית. יש לשלב את שני הנוגדנים המשניים, ולדלל לריכוז סופי של 7.5 מיקרוגרם/מ"ל עבור כל נוגדן לקבלת נפח סופי של 100 מיקרוליטר לדגימה. להגן על הנוגדנים מפני אור. הנוגדנים המשניים יכולים להיות מאוחסנים ב 2-8 ° C במשך 6-8 שבועות או ב -80 ° C עד 1 שנה.
  2. שמור את המגלשות בתא הרטוב, והוסף 100 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית לכל דגימה. תן להם לדגור במשך 30 דקות ב RT מוגן מפני אור.
  3. הקש על תמיסת הנוגדנים המשנית העודפת וערם את השקופיות במדף השקופיות. יש לטבול שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת בצנצנת מכתימה מלאה ב-PBS כדי לשטוף את כל הנוגדנים הלא קשורים שנותרו.
  4. הכינו תמיסת DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) (טבלת חומרים), ודללו לריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל עם מי DI. השקיעו את מדף המגלשות בצנצנת צביעה עם תמיסת DAPI, ודגרו במשך 5 דקות ב-RT בחושך.
    הערה: DAPI משמש ככתם פלואורסצנטי עבור DNA דו-גדילי. ניתן להשתמש בפתרון DAPI מוכן מספר פעמים. אחסן את פתרון DAPI המוכן ב- RT. ניתן לאחסן את תרכיז DAPI בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה.
  5. השקיעו את מדף המגלשות למשך 5 דקות בצנצנת מכתימה עם PBS כדי לשטוף את עודפי תמיסת DAPI.

7. הרכבה ואחסון הדגימות, ניתוח מיקרוסקופי

  1. הר את הדגימות עם כיסויים ואמצעי הרכבה (טבלה של חומרים).
    הערה: יש להשתמש רק בכמויות קטנות של אמצעי הרכבה ולנגב את עודפי המדיום ברקמות רטובות. לבשו כפפות, והימנעו מנגוב בטעות של כל מדיום מהכיסויים או המגלשות. הימנעו מהיווצרות בועות, והשתמשו במקלוני צמר גפן כדי ללחוץ בעדינות על הכיסויים כדי להסיר בועות מהמגלשות.
  2. להדמיה, השתמש במיקרוסקופ שדה רחב או במיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: צלם תחילה תמונה של האיזוקונטרול. קצר את זמן החשיפה של מסנני הפלואורסצנטיות (למעט המסנן הכחול עבור DAPI) עד שכמעט ולא ניתן יהיה לזהות אות. לאחר מכן, השתמש בהגדרה זו כדי לבחון את הדגימות המתאימות. חפש אזורים שבהם ניתן לזהות אות פלואורסצנטי בכל דגימה בודדת באמצעות ערוץ הפלואורסצנטי. לאחר צילום תמונה של האזור, התוכנית יוצרת תמונה מורכבת של כל הערוצים ומציגה את אותות הפלואורסצנטיות השונים כחפיפה של צבעים שונים. לאחר מכן ניתן להמשיך לנתח את התמונה לצורך לוקליזציה משותפת עם תוכנות הדמיה כגון ImageJ.
  3. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים.

תוצאות

לפני שהתחלנו באופטימיזציה של הפרוטוקולים שלנו, זיהינו שלבים מרכזיים לצביעה מוצלחת על ידי חיפוש PubMed עבור מחקרים שהשתמשו ברקמת FFPE עבור צביעה חיסונית של NETs והשווינו את הפרוטוקולים שלהם. הבדלי הפרוטוקול המבטיחים ביותר זוהו כשלבי המפתח למיטוב הפרוטוקול, בעוד שצעדים שרובם תאמו זה את זה לא שונ?...

Discussion

בעבודה זו שאפנו להתאים ולייעל את הפרוטוקולים הקיימים להדמיית NET לסוגי רקמות נוספים, החל מתהליך הצביעה בפועל. הצעד הקריטי הראשון לשיטה זו הוא בחירת הנוגדנים המתאימים ביותר. עבור NE, ניסינו נוגדן NE מפונדקאי עכבר על רקמה אנושית, אשר לא הראה כתמים אמינים בהשוואה ל- NE ממארח ארנב. יתר על כן, Thålin et al...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נוסד על ידי חברת המחקר הגרמנית (BO5534). אנו מודים לאנטוניה קיוויט, מוריץ לנץ, יוהנה האגנס, ד"ר אניקה הואר וד"ר אינגו קוניגס על שסיפקו לנו דגימות. בנוסף, המחברים מודים לצוות של מתקן הדמיה מיקרוסקופיה UKE (מתקן הליבה, בית הספר לרפואה של UKE) על התמיכה במיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
      Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µgabcamAb 68672 1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µgabcamAb 51031:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µgabcamAb 259891:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µgabcamAb 908101:50
Axiovision Microscopy Software Zeiss4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50mlGeneTex GTX30972
CoverslipsMarienfeld0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS antibody dilution 500 mLDCS diagnosticsDCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Donkey anti rabbit AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Donkey anti rabbit Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G Mounting MediumInvitrogen00-4958-02
Glass slide rackRothH552.1
Human/Mouse MPO AntibodyR&D SystemsAF 3667 1:20
Hydrophobic PenKISKERMKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mgabcamAb 374151:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
Microscopy cameraZeissAxioCamHR3
MicrowaveBoschHMT84M421
Mouse IgG1 negative controlDakoX0931 Aglient1:50 and 1:5
Normal Goat IgG ControlR&D SystemsAB-108-C 1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP staining jarRoth2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µgabcamAb 2194061:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µgabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth 6640
SuperFrost Plus slidesR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
Water bathMemmert830476
Water bath rice cookerreishungerRCP-30
Wet chamberWeckert Labortechnik600016
Zeiss Widefield microscopeZeissAxiovert 200M

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NETsDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved