Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont libérés par les neutrophiles en réponse à une infection bactérienne ou à une lésion traumatique des tissus, mais jouent également un rôle dans les maladies auto-immunes et l’inflammation stérile. Ce sont des structures en forme de toile composées de filaments d’ADN double brin, d’histones et de protéines antimicrobiennes. Une fois libérées, les TNE peuvent piéger et tuer les agents pathogènes extracellulaires dans le sang et les tissus. De plus, les TNE participent à la régulation homéostatique en stimulant l’adhésion plaquettaire et la coagulation. Cependant, la production déréglée de TNE a également été associée à diverses maladies, notamment la septicémie ou les maladies auto-immunes, ce qui en fait une cible prometteuse pour une intervention thérapeutique. Outre la microscopie électronique, la visualisation des TNE à l’aide de l’imagerie par immunofluorescence est actuellement l’une des seules méthodes connues pour démontrer les interactions TNE dans les tissus. Par conséquent, diverses méthodes de coloration ont été utilisées pour visualiser les TNE. Dans la littérature, différents protocoles de coloration sont décrits, et nous avons identifié quatre composantes clés présentant une grande variabilité entre les protocoles : (1) les types d’anticorps utilisés, (2) l’utilisation d’agents autoréducteurs, (3) les méthodes de récupération d’antigènes, et (4) la perméabilisation. Par conséquent, les protocoles de coloration par immunofluorescence in vitro ont été systématiquement adaptés et améliorés dans ce travail pour les rendre applicables à différentes espèces (souris, humains) et tissus (peau, intestin, poumon, foie, cœur, disque vertébral). Après la fixation et l’enrobage de paraffine, des profilés de 3 μm d’épaisseur ont été montés sur des lames. Ces échantillons ont été colorés avec des anticorps primaires contre la myéloperoxydase (MPO), l’histone H3 citrullinée (H3cit) et l’élastase neutrophile (NE) selon un protocole de coloration modifié. Les lames ont été colorées avec des anticorps secondaires et examinées à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ. Les résultats ont été analysés à l’aide d’une fiche d’évaluation et les différences ont été enregistrées de manière semi-quantitative.

Nous présentons ici un protocole de coloration NET optimisé adapté à différents tissus. Nous avons utilisé un nouvel anticorps primaire pour colorer H3cit et réduit la coloration non spécifique avec un agent autoréducteur. De plus, nous avons démontré que la coloration NET nécessite une température élevée constante et une manipulation soigneuse des échantillons.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) ont été visualisés pour la première fois par Brinkmann et al. comme une voie de mort cellulaire différente de l’apoptose et de la nécrose en 2004¹. Dans cette voie, les neutrophiles libèrent leur chromatine décondensée dans l’espace extracellulaire pour former de grandes structures en forme de toile recouvertes de protéines antimicrobiennes qui étaient auparavant stockées dans les granules ou le cytosol. Ces protéines antimicrobiennes comprennent l’élastase neutrophile (NE), la myéloperoxydase (MPO) et l’histone citrullinée H3 (H3cit), qui sont couramment utilisées pour la détection indirecte par immunofluorescence des TNE². Cette méthode permet non seulement d’identifier la présence quantitative de ces protéines ; en effet, il a l’avantage de détecter spécifiquement les structures de type NET. Dans les TNE, les protéines mentionnées co-localisent avec l’ADN extracellulaire, qui peut être détecté par un chevauchement des signaux de fluorescence de chaque protéine colorée et de l’ADN extracellulaire. Contrairement aux signaux qui se chevauchent en raison de la co-localisation de l’ADN extracellulaire et des protéines dans les TNE, les neutrophiles intacts ne présentent aucune co-localisation. Ici, les composants NET sont généralement stockés séparément dans les granulés, les noyaux et le cytosol³.

Depuis leur première découverte, il a été démontré que les TNE jouent un rôle central dans de nombreuses maladies, en particulier celles impliquant une inflammation. Les TNE montrent des fonctions antimicrobiennes pendant l’infection en piégeant et en tuant les agents pathogènes extracellulaires dans le sang et les tissus ^4,5. Cependant, les TNE ont également été associées à des maladies auto-immunes et à des réponses hyperinflammatoires, comme le lupus érythémateux disséminé, l’arthrite rhumatismale et l’asthme allergique ^6,7,8. Les TNE favorisent la vaso-occlusion et l’inflammation dans l’athérosclérose, l’adhésion plaquettaire, et on suppose qu’elles jouent un rôle dans le cancer métastatique 9,10,11. Néanmoins, on pense qu’ils ont des propriétés anti-inflammatoires en réduisant les niveaux de cytokines pro-inflammatoires¹². Alors que les TNE suscitent de plus en plus d’intérêt dans un domaine de recherche plus large, une méthode robuste de détection des TNE est fondamentale pour les recherches futures.

Même si la visualisation des TNE dans différents tissus à l’aide de l’imagerie par immunofluorescence est complexe et nécessite une personnalisation, en dehors de la microscopie électronique, elle est actuellement l’une des méthodes les plus connues pour visualiser les interactions entre les TNE et les cellules et est principalement utilisée dans les tissus enrobés de paraffine fixés au formol (FFPE)^13,14. Cependant, il est difficile de comparer l’imagerie NET, car différents laboratoires utilisent leurs propres protocoles personnalisés. Ces protocoles diffèrent par leur utilisation d’anticorps, de prélèvement d’antigènes ou de méthode de perméabilisation et sont souvent optimisés pour un type spécifique de tissu 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Après que Brinkmann et al. aient publié la première étude méthodique utilisant la visualisation immunofluorescente des TNE dans les tissus FFPE, nous avons voulu optimiser ce protocole pour une plus grande variété de tissus et d’espèces¹⁵. De plus, afin d’établir un protocole d’immunofluorescence largement applicable, nous avons testé différents protocoles modifiés d’études utilisant des méthodes d’immunofluorescence dans des tissus FFPE pour détecter les TNE 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26 et 27}. De plus, nous avons essayé un nouvel anticorps H3cit pour une coloration extracellulaire plus spécifique²⁸. Nous émettons l’hypothèse qu’en adaptant systématiquement les protocoles de coloration actuels à différentes espèces et tissus, l’imagerie in vitro peut être améliorée, ce qui se traduit par une meilleure représentation de l’interaction entre les neutrophiles et les TNE à la fois localement et systémiquement.

Protocole

Cette étude a inclus des tissus de souris provenant d’expériences approuvées par l’Administration d’État de Hambourg pour la recherche animale, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hambourg, Allemagne (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Les tissus utilisés étaient des poumons et du côlon de souris provenant d’un modèle septique et de peau brûlée. Nous avons utilisé des souris mâles et femelles âgées de 8 semaines. La directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques a été respectée pour toutes les expériences. Les échantillons humains anonymisés comprenaient des tissus d’entérocolite néonatale, de peau brûlée, d’atrésie des voies biliaires, de spondylodiscite et de myocarde. Selon le Comité d’éthique de la recherche médicale de Hambourg, les échantillons n’avaient pas besoin d’un consentement éclairé, mais l’étude a été approuvée par le comité (WF-026/21).

1. Fixation de l’échantillon

1. Utiliser le protocole suivant dérivé d’Abu Abed et Brinkmann pour la fixation des échantillons, la déshydratation, l’enrobage de paraffine, la coupe et le montage ^3,15.
   1. Préparer une solution de formaldéhyde à 4 % en dissolvant 40 g de paraformaldéhyde (PFA) dans 800 mL de solution saline tamponnée Tris, pH 7,4 (TBS).
   2. Remuez le mélange à 60 °C sous une hotte jusqu’à ce que le PFA soit dissous. Amenez la solution à température ambiante (RT) et ajustez le volume à l’aide d’un TBS à 1 000 ml.
   3. Ajustez le pH à 7,4. Conserver à 4 °C pendant 2 à 3 semaines ou à −20 °C jusqu’à 1 an.
2. Pour la fixation de l’échantillon, placez le tissu frais dans le tampon TBS et disséquez-le en morceaux de moins de 20 mm x 30 mm x 3 mm. Immergez les coupes de tissu dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 12 à 24 h.
   REMARQUE : Le protocole original utilisait une solution de PFA à 2 % et un temps de fixation de 8 à 20 h. Avec cette méthode, certaines coupes de tissu n’étaient pas complètement fixées après 20 h, de sorte que la concentration de PFA a été augmentée à 4% de PFA.
3. Transférez les échantillons dans des cassettes de traitement des tissus étiquetées. Utilisez des marqueurs ou des crayons résistants aux solvants pour l’étiquetage.
4. Commencer la déshydratation de l’échantillon en immergeant ensuite les cassettes dans de l’éthanol à 70% pendant 1 h. Ensuite, plongez dans 80 % d’éthanol, 90 % d’éthanol, 96 % d’éthanol et deux fois dans de l’éthanol à 100 %, chaque étape durant 1 h.
5. Plonger deux fois dans du xylène à 100 % (diméthylbenzène) puis deux fois dans de la paraffine à 60 °C pendant 1 h à chaque fois.
6. Utilisez des moules d’encastrement pour le montage et laissez la paraffine se solidifier avant de retirer le moule.
7. Utilisez un microtome pour découper des coupes de tissu de 3 μm d’épaisseur.
8. Utilisez une pince à épiler pour déposer les sections coupées dans un bain-marie à 37 °C et laissez-les flotter sur la surface pour étirer les coupures de tissu.
9. Placez les sections sur des lames de verre adhésives (Table des matériaux) et laissez-les sécher toute la nuit dans une chambre de chauffe à 40 °C.

2. Réhydratation de l’échantillon

1. Pour la déparaffinisation, empilez les lames dans un support à lames et plongez-les deux fois pendant 5 minutes chacune dans le limonène, un milieu de remplacement au xylène (tableau des matériaux) et une fois pendant 5 minutes dans un mélange limonène/éthanol 1 :1.
   ATTENTION : Le limonène est inflammable à 50 °C et peut provoquer des réactions allergiques. S’utilise sous une hotte avec une protection oculaire et des gants. Tenir à l’écart des feux ouverts.
2. Réhydrater les échantillons dans une série d’éthanol descendant en immergeant le support de lames deux fois dans de l’éthanol à 100 % et une fois dans de l’éthanol à 96 %, de l’éthanol à 90 %, de l’éthanol à 80 % et de l’éthanol à 70 % pendant 5 min chacun.
3. Plongez la grille à lames pendant 5 minutes dans de l’eau déminéralisée (eau DI) pour éliminer tout éthanol restant.

3. Blocage de l’autofluorescence et récupération de l’antigène

1. Préparer la solution de récupération cible de citrate de pH 6 (TRS) (Table des matériaux) conformément à la fiche technique. Ce TRS est concentré 10 fois. Par conséquent, diluez 1 :10 avec de l’eau DI. Préchauffer dans un bocal en plastique à 96 °C.
   REMARQUE : Le TRS brise les ponts méthylènes formés lors de la fixation de l’échantillon pour exposer les épitopes de l’antigène. Cela permet aux anticorps primaires de se lier à leur antigène cible. Conserver le TRS concentré à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant 8 mois. Préparez toujours du TRS frais.
2. Sortez les lames du support de diapositives et placez-les dans une chambre humide. Pipeter une à deux gouttes d’agent autoréducteur (tableau des matériaux) sur chaque échantillon. Incuber pendant 5 min.
   REMARQUE : L’agent autoréducteur bloque l’autofluorescence tissulaire inhérente causée par les fluorophores endogènes et les fixateurs. Conservez l’agent autoréducteur d’autofluorescence chez RT jusqu’à 1 an.
   REMARQUE : Ne travaillez qu’avec de petites sections de tissus pour éviter de dessécher les échantillons ou de dépasser le temps d’incubation.
3. Empilez les lames dans le rack de lames et rincez pendant 1 minute dans de l’éthanol à 60 % en effectuant un mouvement ascendant et descendant jusqu’à ce que tout le réactif réducteur d’autofluorescence inutilisé ait été lavé.
4. Plongez le support coulissant pendant 5 min dans de l’eau DI.
5. Pour la récupération de l’antigène, transférez les lames dans un bocal de coloration avec le TRS préchauffé. Incuber pendant 10 min à 96 °C au bain-marie.
   REMARQUE : Le bain-marie à 96 °C peut être remplacé par un four à micro-ondes ou un cuiseur vapeur si le TRS est préchauffé à 96 °C et que 10 min de temps d’incubation à 96 °C sont assurés.
6. Sortez le pot de coloration et laissez-le refroidir lentement jusqu’à ce qu’il soit RT pendant environ 60 à 90 minutes.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici jusqu’à 4 h, laissant les diapositives dans le TRS.
7. Retirez le TRS, mais conservez les lames dans le bocal. Rincez deux fois avec une solution saline tamponnée Tris avec 0,05 % Tween (TBST, pH 7,4) pendant 3 minutes chacune pour éliminer les résidus de TRS restants.
8. Pour la perméabilisation, préparez 0,2 % de Triton dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, et remplissez-le dans le bocal de coloration pour perméabiliser les échantillons pendant 10 min.
   REMARQUE : La perméabilisation améliore la liaison des anticorps primaires avec les protéines cibles intracellulaires dans les échantillons fixés.
9. Rincez à nouveau les lames deux fois dans TBST pendant 3 min à chaque fois.
10. Préparez la chambre humide et posez les lames. Essuyez l’excès d’eau des lames avec des mouchoirs en papier. Encerclez chaque échantillon avec un stylo barrière hydrophobe pour empêcher la solution d’anticorps de s’écouler.
    REMARQUE : Ne laissez pas les échantillons sécher. Il est préférable de travailler avec de petites sections.

4. Blocage de la liaison aux anticorps non spécifiques

1. Prélever une solution de blocage prête à l’emploi avec du sérum d’ânesse (Table des matériaux) et pipeter une goutte sur chaque échantillon. Incuber pendant 30 min à RT.
   REMARQUE : Cette étape de blocage minimise la liaison de l’anticorps secondaire aux sites de liaison non spécifiques de l’échantillon. Après avoir bloqué ces épitopes non spécifiques et appliqué l’anticorps primaire, l’anticorps secondaire se liera à l’anticorps primaire et n’interagira pas avec la surface du tissu. Ce réactif bloquant prêt à l’emploi est conservé entre 2 et 8 °C pendant 6 mois.
2. Retirez l’excès de solution de blocage des lames en tapotant le bord des lames contre une surface dure. Ne les rincez pas.

5. Anticorps primaires

1. Diluer les anticorps primaires dans le tampon de dilution des anticorps (tableau des matériaux). Utilisez environ 100 μL de la solution finale pour chaque échantillon. Pour l’anticorps NE et H3cit (R8) et l’isocontrôle, diluer à une concentration de 5 μg/mL. Pour le MPO et l’isocontrôle correspondant, utiliser 10 μg/mL. Préparez un tube pour chaque anticorps primaire et un pour chaque anticorps isocontrol.
   REMARQUE : H3cit (R8)/MPO ou NE/MPO et leurs isocontrôles peuvent être combinés pour la coloration des TNE. Pour la combinaison H3cit (R8)/MPO, diluer à une concentration finale de 5 μg/mL pour H3cit (R8) et de 10 μg/mL pour MPO jusqu’à un volume final de 100 μL par échantillon. Pour l’EN/MPO, diluer à une concentration finale de 5 μg/mL pour l’EN, et de 10 μg/mL pour la MPO, jusqu’à un volume final de 100 μL par échantillon. Pour l’isocontrol, utiliser la même concentration que pour chaque anticorps correspondant. Utilisez toujours un nouvel embout de pipette pour chaque anticorps utilisé. Les anticorps primaires peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 à 2 semaines et à −20 °C ou −80 °C jusqu’à 1 an.
2. Avec deux échantillons sur une lame, utilisez un pour les anticorps isocontrol et un pour la dilution des anticorps MPO/H3cit ou MPO/NE. Utilisez environ 100 μL pour chaque échantillon et répartissez uniformément la solution d’anticorps.
   REMARQUE : Ne laissez pas les échantillons sécher. Veillez à ne pas confondre l’isocontrôle et les anticorps primaires.
3. Conserver dans une chambre humide toute la nuit à 4 °C.
4. Le lendemain, prélevez l’excès de solution d’anticorps primaire des lames et empilez les lames dans une cuvette. Rincez trois fois pendant 5 minutes à chaque fois avec TBST pour éliminer la solution d’anticorps primaire restante.

6. Anticorps secondaire

1. Préparez la solution d’anticorps secondaire. Utilisez deux anticorps secondaires fluorescents différents : âne-anti-chèvre pour le MPO et âne-anti-lapin pour la coloration H3cit. Diluer chacun d’eux à une concentration de 7,5 μg/mL avec un tampon de dilution d’anticorps (tableau des matériaux).
   REMARQUE : Pour la double coloration, utilisez deux anticorps fluorescents avec des zones d’excitation différentes et un chevauchement spectral minimal. Combinez les deux anticorps secondaires et diluez jusqu’à une concentration finale de 7,5 μg/mL pour chaque anticorps pour un volume final de 100 μL par échantillon. Protégez les anticorps de la lumière. Les anticorps secondaires peuvent être conservés à une température de 2 à 8 °C pendant 6 à 8 semaines ou à une température de −80 °C pendant 1 an.
2. Conservez les lames dans la chambre humide et ajoutez 100 μL de la solution d’anticorps secondaire sur chaque échantillon. Laissez-les incuber pendant 30 min à RT et à l’abri de la lumière.
3. Tapotez l’excès de solution d’anticorps secondaire et empilez les lames dans le rack à lames. Immergez-les trois fois pendant 5 minutes chacune dans un bocal de coloration rempli de PBS pour éliminer les anticorps non liés restants.
4. Préparer la solution de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindol) (tableau des matériaux) et diluer à une concentration de 1 μg/mL avec de l’eau déminéralisée. Immergez le support de lames dans un bocal de coloration avec la solution DAPI et incubez pendant 5 minutes à RT dans l’obscurité.
   REMARQUE : DAPI est utilisé comme colorant fluorescent pour l’ADN double brin. La solution DAPI préparée peut être utilisée plusieurs fois. Conservez la solution DAPI préparée chez RT. Le concentré DAPI peut être conservé à −20 °C jusqu’à 1 an.
5. Immergez la grille à lames pendant 5 minutes dans un bocal de coloration avec du PBS pour éliminer l’excès de solution DAPI.

7. Montage et stockage des échantillons, analyse microscopique

1. Montez les échantillons à l’aide de lamelles et d’un support de montage (Table des matériaux).
   REMARQUE : N’utilisez que de petites quantités de milieu de montage et essuyez l’excès de milieu avec des mouchoirs humides. Portez des gants et évitez d’essuyer accidentellement tout support des lamelles ou des lames. Évitez la formation de bulles et utilisez des cotons-tiges pour appuyer doucement sur les lamelles afin d’éliminer les bulles des lames.
2. Pour l’imagerie, utilisez un microscope à grand champ ou un microscope confocal.
   REMARQUE : Prenez d’abord une image de l’isocontrol. Réduisez le temps d’exposition des filtres de fluorescence (à l’exception du filtre bleu pour le DAPI) jusqu’à ce qu’il n’y ait presque plus de signal détectable. Ensuite, utilisez ce paramètre pour examiner les échantillons correspondants. Recherchez les zones où un signal fluorescent peut être détecté dans chaque échantillon individuel à l’aide du canal de fluorescence. Après avoir pris une image de la zone, le programme génère une image composée de tous les canaux et affiche les différents signaux de fluorescence sous forme de chevauchement de différentes couleurs. L’image peut ensuite être analysée plus en détail pour la co-localisation avec un logiciel d’imagerie tel qu’ImageJ.
3. Conservez les lames à 4 °C jusqu’à 6 mois.

Résultats

Avant de commencer l’optimisation de notre protocole, nous avons identifié les étapes clés d’une coloration réussie en recherchant dans PubMed des études utilisant des tissus FFPE pour l’immunomarquage des TNE et en comparant leurs protocoles. Les différences de protocole les plus prometteuses ont été identifiées comme les étapes clés de l’optimisation du protocole, tandis que les étapes qui correspondaient pour la plupart les unes aux autres n’ont pas été modifiées (tableau 1).<...

Discussion

Dans ce travail, nous avons cherché à adapter et à optimiser les protocoles existants pour l’imagerie des TNE à un plus grand nombre de types de tissus, en commençant par le processus de coloration proprement dit. La première étape critique de cette méthode est la sélection des anticorps les plus appropriés. Pour l’EN, nous avons testé un anticorps anti-NE provenant d’un hôte de souris sur des tissus humains, qui n’a montré aucune coloration fiable par rapport à l’EN, provenant d’un hôte lapin....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M