인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

요약

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

초록

호중구 세포외 트랩(NET)은 박테리아 감염이나 외상성 조직 손상에 대한 반응으로 호중구에 의해 방출되지만 자가면역 질환 및 멸균 염증에도 중요한 역할을 합니다. 그들은 이중 가닥 DNA 필라멘트, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조입니다. 일단 방출되면 NET은 혈액과 조직에서 세포 외 병원체를 포획하여 죽일 수 있습니다. 또한 NET은 혈소판 부착 및 응고를 자극하여 항상성 조절에 참여합니다. 그러나 NET의 생산 조절 장애는 패혈증 또는 자가면역 질환을 포함한 다양한 질병과도 관련이 있어 치료 개입의 유망한 표적이 됩니다. 전자 현미경 외에도 면역 형광 이미징을 사용하여 NET을 시각화하는 것은 현재 조직에서 NET 상호 작용을 입증하는 유일한 알려진 방법 중 하나입니다. 따라서 NET을 시각화하기 위한 다양한 염색 방법이 활용되었습니다. 문헌에는 다양한 염색 프로토콜이 설명되어 있으며, 프로토콜 간에 높은 변동성을 보이는 네 가지 주요 구성 요소, 즉 (1) 사용된 항체 유형, (2) 자가형광 환원제의 사용, (3) 항원 회수 방법, (4) 투과성을 확인했습니다. 따라서 체외 면역형광 염색 프로토콜은 이 연구에서 다양한 종(마우스, 인간) 및 조직(피부, 장, 폐, 간, 심장, 척추 디스크)에 적용할 수 있도록 체계적으로 조정되고 개선되었습니다. 고정 및 파라핀 포매 후, 3μm 두께의 섹션을 슬라이드에 장착했습니다. 이 샘플은 수정된 염색 프로토콜에 따라 골수과산화효소(MPO), 시트룰린 히스톤 H3(H3cit) 및 호중구 엘라스타제(NE)에 대한 1차 항체로 염색되었습니다. 슬라이드를 2차 항체로 염색하고 광시야 형광 현미경을 사용하여 검사했습니다. 평가 시트에 따라 결과를 분석하고, 반정량적으로 차이를 기록했다.

여기에서는 다양한 조직에 적합한 최적화된 NET 염색 프로토콜을 제시합니다. H3cit 염색을 위해 새로운 1차 항체를 사용하고 자가형광 환원제로 비특이적 염색을 줄였습니다. 또한, NET 염색에는 일정한 고온과 신중한 시료 취급이 필요하다는 것을 입증했습니다.

서문

호중구 세포외 트랩(NETs)은 2004년 Brinkmann et al.에 의해 세포사멸 및 괴사와 다른 세포 사멸 경로로 처음 시각화되었습니다¹. 이 경로에서 호중구는 탈응축된 염색질을 세포 외 공간으로 방출하여 이전에 과립이나 세포질에 저장되었던 항균 단백질로 덮인 큰 거미줄 모양의 구조를 형성합니다. 이러한 항균 단백질에는 호중구 엘라스타제(ne), 골수화효소(MPO) 및 시트룰린 히스톤 H3(H3cit)가 포함되며, 이는 NET의 간접 면역형광 검출에 일반적으로 사용됩니다². 이 방법은 이러한 단백질의 정량적 존재를 식별할 뿐만 아니라; 실제로 NET과 유사한 구조를 구체적으로 감지할 수 있다는 장점이 있습니다. NET에서 언급된 단백질은 세포외 DNA와 함께 국소화되며, 이는 각 염색된 단백질과 세포외 DNA의 형광 신호의 중첩에 의해 검출될 수 있습니다. NET에서 세포외 DNA와 단백질의 공동 국소화로 인한 중첩 신호와 대조적으로, 온전한 호중구는 공동 국소화를 나타내지 않습니다. 여기서, NET 성분은 일반적으로 과립, 핵 및 세포질³에 별도로 저장된다.

첫 번째 발견 이후 NET은 수많은 질병, 특히 염증과 관련된 질병에서 중심적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다. NET은 혈액과 조직에서 세포외 병원체를 포획하고 사멸시킴으로써 감염 중 항균 기능을 보여줍니다 ^4,5. 그러나 NET은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 및 알레르기성 천식과 같은 자가면역 질환 및 과염증 반응과도 관련이 있습니다 ^6,7,8. NET은 죽상동맥경화증, 혈소판 부착에서 혈관 폐색과 염증을 촉진하며 전이성 암에 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다 9,10,11. 그럼에도 불구하고, 그들은 전염증성 사이토카인 수치를 감소시킴으로써 항염증 특성을 가지고 있다고 생각된다¹². NET은 광범위한 연구 분야에서 더 많은 관심을 받고 있지만, 강력한 NET 검출 방법은 향후 연구의 기본입니다.

면역형광 이미징을 사용하여 다양한 조직에서 NET을 시각화하는 것은 복잡하고 맞춤화가 필요하지만, 전자 현미경을 제외하고는 현재 NET과 세포 간의 상호 작용을 시각화하는 가장 유명한 방법 중 하나이며 주로 포르말린 고정 파라핀 포매 조직(FFPE)에 사용됩니다^13,14. 그러나 여러 실험실에서 자체 맞춤형 프로토콜을 사용하기 때문에 NET 이미징을 비교하는 것은 어렵습니다. 이러한 프로토콜은 항체, 항원 회수 또는 투과화 방법의 사용이 다르며 종종 특정 유형의 조직에 최적화되어 있습니다 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Brinkmann et al.이 FFPE 조직에서 NET의 면역형광 시각화를 사용한 최초의 방법론적 연구를 발표한 후, 우리는 더 다양한 조직과 종에 대해 이 프로토콜을 최적화하기를 원했습니다¹⁵. 또한 광범위하게 적용 가능한 면역형광 프로토콜을 확립하기 위해 FFPE 조직에서 면역형광 방법을 사용하여 NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25를 검출하는 연구에서 다양한 수정된 프로토콜을 테스트했습니다^{. 26,27}. 또한, 보다 특이적인 세포외 염색을 위해 새로운 H3cit 항체를 시도했다²⁸. 우리는 현재의 염색 프로토콜을 다양한 종과 조직에 체계적으로 적용함으로써 체외 이미징을 개선하여 호중구와 NET 간의 상호 작용을 국소 및 전신적으로 더 잘 표현할 수 있다는 가설을 세웠습니다.

프로토콜

이 연구에는 독일 함부르크의 Behörde für Justiz und Verbraucherschutz에 있는 함부르크 주 동물 연구국(Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)에서 승인한 실험에서 파생된 마우스 조직이 포함되었습니다(73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). 사용된 조직은 패혈증 모델의 쥐 폐와 결장과 화상을 입은 피부였습니다. 우리는 8주 된 수컷과 암컷 쥐를 사용했습니다. 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU는 모든 실험에 대해 준수되었습니다. 익명화된 인간 샘플에는 신생아 장염, 화상을 입은 피부, 담도 폐쇄증, 척추 디스크염 및 심근의 조직이 포함되었습니다. 함부르크 의학 연구 윤리 위원회(Medical Research Ethics Committee of Hamburg)에 따르면, 샘플은 정보에 입각한 동의가 필요하지 않았지만, 연구는 위원회의 승인을 받았다(WF-026/21).

1. 샘플 고정

1. Abu Abed 및 Brinkmann에서 파생된 다음 프로토콜을 샘플 고정, 탈수, 파라핀 임베딩, 절편화 및 장착에 사용합니다 ^3,15.
   1. 4mL의 트리스 완충 식염수(pH 800(TBS))에 파라포름알데히드(PFA) 40g을 용해시켜 7.4% 포름알데히드 용액을 준비합니다.
   2. PFA가 용해될 때까지 흄 후드 아래에서 60°C의 혼합물을 저어줍니다. 용액을 실온(RT)으로 가져오고 TBS로 부피를 1,000mL로 조정합니다.
   3. pH를 7.4로 조정합니다. 4 °C에서 2-3 주 동안 또는 -20 °C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
2. 샘플 고정을 위해 TBS 완충액에 새 조직을 넣고 20mm x 30mm x 3mm보다 작은 조각으로 절개합니다. 조직 절편을 4% 파라포름알데히드 용액에 12-24시간 동안 담그십시오.
   참고: 원래 프로토콜은 2% PFA 용액과 8-20시간의 고정 시간을 사용했습니다. 이 방법을 사용하면 일부 조직 절편이 20시간 후에 완전히 고정되지 않아 PFA 농도가 4% PFA로 증가했습니다.
3. 샘플을 라벨이 부착된 조직 처리 카세트로 옮깁니다. 라벨링에는 내용제성 마커 또는 연필을 사용하십시오.
4. 샘플 탈수를 시작한 다음 카세트를 70% 에탄올에 1시간 동안 담그십시오. 그런 다음 80% 에탄올, 90% 에탄올, 96% 에탄올, 100% 에탄올에 두 번 담그고 각 단계는 1시간 동안 지속됩니다.
5. 100% 크실렌(디메틸벤젠)에 두 번 담근 다음 60°C 파라핀에 매번 1시간 동안 두 번 담그십시오.
6. 장착용 임베딩 몰드를 사용하고 몰드를 제거하기 전에 파라핀이 응고되도록 하십시오.
7. 마이크로톰을 사용하여 3μm 두께의 조직 절편을 절단합니다.
8. 핀셋을 사용하여 절단된 부분을 37°C 수조에 놓고 표면에 띄워 조직 절단을 늘립니다.
9. 단면을 접착 유리 슬라이드(재료 표)에 놓고 40°C 가열 챔버에서 밤새 건조시킵니다.

2. 시료 재수화

1. 탈파라핀화를 위해 슬라이드를 슬라이드 랙에 쌓고 크실렌 교체 매체 리모넨(재료 표)에 각각 5분 동안 두 번 담그고 1:1 리모넨/에탄올 혼합물에 5분 동안 한 번 담그십시오.
   주의 : 리모넨은 50 °C에서 가연성이며 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. 보안경과 장갑을 착용한 흄 후드 아래에서 사용하십시오. 화기에 가까이 두지 마십시오.
2. 슬라이드 랙을 100% 에탄올에 두 번, 96% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올 및 70% 에탄올에 각각 5분 동안 담가 샘플을 내림차순 에탄올 시리즈로 재수화합니다.
3. 슬라이드 랙을 탈이온수(DI 물)에 5분 동안 담가 남아 있는 에탄올을 제거합니다.

3. 자가형광 차단 및 항원 회수

1. 데이터시트에 따라 pH 6 구연산염 표적 회수 용액(TRS)(재료 표)을 준비합니다. 이 TRS는 10배 농축됩니다. 따라서 DI 물로 1:10을 희석하십시오. 플라스틱 염색 용기를 96°C로 예열합니다.
   참고: TRS는 항원 에피토프를 노출시키기 위해 샘플 고정 중에 형성된 메틸렌 브리지를 파괴합니다. 이를 통해 1차 항체가 표적 항원과 결합할 수 있습니다. 농축 TRS를 2-8 °C에서 8 개월 동안 보관하십시오. 항상 신선한 TRS를 준비하십시오.
2. 슬라이드 랙에서 슬라이드를 꺼내 젖은 챔버에 놓습니다. 각 샘플에 자가형광 환원제(Table of Materials)를 1-2방울 떨어뜨리는 피펫팅합니다. 5분 동안 배양합니다.
   NOTE: 자가형광 환원제는 내인성 형광단 및 고정제에 의해 발생하는 고유한 조직 자가형광을 차단합니다. 자가형광 환원제를 RT에서 최대 1년 동안 보관합니다.
   알림: 샘플이 마르거나 배양 시간을 초과하지 않도록 조직의 작은 부분으로만 작업하십시오.
3. 슬라이드를 슬라이드 랙에 다시 쌓고 사용하지 않은 자가형광 환원 시약이 모두 씻겨 나갈 때까지 위아래로 움직여 60% 에탄올로 1분 동안 헹굽니다.
4. 슬라이드 랙을 DI 물에 5분 동안 담그십시오.
5. 항원 회수를 위해 슬라이드를 예열된 TRS가 있는 염색 용기에 옮깁니다. 수조에서 96°C에서 10분간 배양합니다.
   알림: TRS를 96°C로 예열하고 96°C에서 10분의 배양 시간이 보장되는 경우 96°C 수조를 전자레인지나 스팀 쿠커로 대체할 수 있습니다.
6. 염색 용기를 꺼내 약 60-90분 동안 RT로 천천히 식힙니다.
   알림: 프로토콜은 여기에서 최대 4시간 동안 일시 중지할 수 있으며 슬라이드는 TRS에 남아 있습니다.
7. TRS를 제거하되 슬라이드는 항아리에 보관하십시오. 0.05% 트윈(TBST, pH 7.4)이 포함된 트리스 완충 식염수로 각각 3분 동안 두 번 헹구어 남은 TRS 잔여물을 씻어냅니다.
8. 투과를 위해 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.2% 트리톤을 준비하고 염색 용기에 채워 10분 동안 샘플을 투과시킵니다.
   참고: 투과화는 고정된 샘플에서 세포 내 표적 단백질과 1차 항체의 결합을 향상시킵니다.
9. 매번 TBST에서 3분 동안 슬라이드를 두 번 다시 헹굽니다.
10. 습식 챔버를 준비하고 슬라이드를 놓습니다. 종이 티슈로 슬라이드의 과도한 물기를 닦아냅니다. 항체 용액이 흘러내리지 않도록 소수성 장벽 펜으로 모든 샘플에 동그라미를 칩니다.
    알림: 샘플을 건조시키지 마십시오. 작은 섹션으로 작업하는 것이 가장 좋습니다.

4. 비특이적 항체 결합 차단

1. 당나귀 혈청(Table of Materials)과 함께 바로 사용할 수 있는 차단 용액을 모든 샘플에 한 방울 떨어뜨리고 피펫팅합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
   참고: 이 차단 단계는 샘플의 비특이적 결합 부위에 대한 2차 항체의 결합을 최소화합니다. 이러한 비특이적 항원결정기를 차단하고 1차 항체를 투여한 후 2차 항체는 1차 항체에 결합하고 조직 표면과 상호작용하지 않습니다. 바로 사용할 수 있는 이 차단 시약은 2-8°C에서 6개월 동안 보관됩니다.
2. 슬라이드의 가장자리를 단단한 표면에 두드려 슬라이드에서 과도한 차단 용액을 제거합니다. 헹구지 마십시오.

5. 1차 항체

1. 항체 희석 완충액에 1차 항체를 희석합니다(재료 표). 모든 샘플에 약 100μL의 최종 용액을 사용합니다. NE 및 H3cit(R8) 항체 및 isocontrol의 경우 5μg/mL 농도로 희석합니다. MPO 및 해당 isocontrol의 경우 10μg/mL를 사용합니다. 모든 1차 항체에 대해 하나의 튜브를 준비하고 모든 isocontrol 항체에 대해 하나의 튜브를 준비합니다.
   알림: H3cit(R8)/MPO 또는 NE/MPO와 그 isocontrols는 NET 염색을 위해 결합할 수 있습니다. H3cit(R8)/MPO의 조합의 경우 H3cit(R8)의 경우 5μg/mL, MPO의 경우 10μg/mL의 최종 농도로 희석하여 샘플당 100μL의 최종 부피로 희석합니다. NE/MPO의 경우 NE의 경우 5μg/mL, MPO의 경우 10μg/mL의 최종 농도로 희석하여 샘플당 최종 부피 100μL로 희석합니다. isocontrol의 경우 각 해당 항체에 대해 동일한 농도를 사용합니다. 사용하는 각 항체에 대해 항상 새 피펫 팁을 사용하십시오. 1차 항체는 4°C에서 1-2주, -20°C 또는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
2. 하나의 슬라이드에 두 개의 샘플이 있는 경우 하나는 isocontrol 항체에 사용하고 다른 하나는 MPO/H3cit 또는 MPO/NE 항체 희석에 사용합니다. 모든 샘플에 약 100μL를 사용하고 항체 용액을 고르게 펴 바릅니다.
   알림: 샘플이 마르지 않도록 하십시오. isocontrol 항체와 1차 항체를 혼동하지 않도록 주의하십시오.
3. 4 °C의 습식 챔버에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
4. 다음 날, 슬라이드에서 여분의 1차 항체 용액을 두드려 큐벳에 쌓습니다. TBST로 매번 5분 동안 3회 헹구어 남은 1차 항체 용액을 씻어냅니다.

6. 2차 항체

1. 2차 항체 용액을 준비합니다. 두 가지 형광 2차 항체를 사용합니다: MPO용 donkey-anti-goat 및 H3cit 염색용 donkey-anti-rabbit. 항체 희석 완충액을 사용하여 각각을 7.5μg/mL의 농도로 희석합니다(재료 표).
   참고: 이중 염색의 경우, excitation 영역이 다르고 스펙트럼 중첩이 최소화된 두 개의 형광 항체를 사용하십시오. 두 2차 항체를 결합하고 샘플당 100μL의 최종 부피에 대해 각 항체에 대해 7.5μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 빛으로부터 항체를 보호하십시오. 2차 항체는 2-8°C에서 6-8주 또는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
2. 슬라이드를 습식 챔버에 보관하고 모든 샘플에 100μL의 2차 항체 용액을 추가합니다. 빛으로부터 보호하고 상온에서 30분 동안 배양하도록 합니다.
3. 여분의 2차 항체 용액을 떼어내고 슬라이드 랙에 슬라이드를 쌓습니다. PBS로 채워진 염색 용기에 각각 5분 동안 3회 담가 남아 있는 결합되지 않은 항체를 씻어냅니다.
4. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindol) 용액(재료 표)을 준비하고 DI 물로 1μg/mL 농도로 희석합니다. 슬라이드 랙을 DAPI 용액이 있는 염색 용기에 담그고 어두운 곳에서 RT에서 5분 동안 배양합니다.
   참고: DAPI는 이중 가닥 DNA의 형광 염색제로 사용됩니다. 준비된 DAPI 솔루션은 여러 번 사용할 수 있습니다. 준비된 DAPI 솔루션을 RT에 저장합니다. DAPI 농축액은 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
5. 슬라이드 랙을 PBS가 있는 염색 용기에 5분 동안 담가 과도한 DAPI 용액을 씻어냅니다.

7. 샘플 장착 및 보관, 현미경 분석

1. 커버슬립과 장착 매체가 있는 샘플을 장착합니다(재료 표).
   알림: 소량의 장착 매체만 사용하고 여분의 매체는 젖은 티슈로 닦아내십시오. 장갑을 착용하고 커버슬립이나 슬라이드에서 실수로 매체를 닦아내지 마십시오. 기포가 생기지 않도록 하고 면봉을 사용하여 커버슬립을 부드럽게 눌러 슬라이드에서 기포를 제거합니다.
2. 이미징의 경우 광시야 현미경 또는 컨포칼 현미경을 사용하십시오.
   참고: 먼저 isocontrol의 이미지를 찍습니다. 신호가 거의 감지되지 않을 때까지 형광 필터(DAPI용 청색 필터 제외)의 노출 시간을 낮춥니다. 그런 다음 이 설정을 사용하여 해당 샘플을 검사합니다. 형광 채널을 사용하여 모든 개별 샘플에서 형광 신호를 검출할 수 있는 영역을 찾습니다. 영역 이미지를 촬영한 후 프로그램은 모든 채널의 복합 이미지를 생성하고 서로 다른 형광 신호를 서로 다른 색상의 중첩으로 표시합니다. 그런 다음 ImageJ와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 공동 위치 파악을 위해 이미지를 추가로 분석할 수 있습니다.
3. 슬라이드를 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

결과

프로토콜 최적화를 시작하기 전에 PubMed에서 NET의 면역 염색을 위해 FFPE 조직을 사용한 연구를 검색하고 프로토콜을 비교하여 성공적인 염색을 위한 주요 단계를 식별했습니다. 가장 유망한 프로토콜 차이는 프로토콜 최적화를 위한 핵심 단계로 확인되었으며, 대부분 서로 일치하는 단계는 변경되지 않았습니다(표 1).

표 1: NET의 FFPE 면역염색을 위한 PubMed 연...

토론

이 연구에서 우리는 실제 염색 과정부터 시작하여 NET을 이미징하기 위한 기존 프로토콜을 더 많은 조직 유형에 적용하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 가장 적합한 항체를 선택하는 것입니다. NE의 경우, 인간 조직에 대한 쥐 숙주의 NE 항체를 시험해 보았는데, 토끼 숙주의 NE에 비해 신뢰할 수 있는 염색이 없었습니다. 또한, Thålin et al.은 H3cit(R8)를 세포외 염...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M