인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

요약

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

초록

호중구 세포외 트랩(NET)은 박테리아 감염이나 외상성 조직 손상에 대한 반응으로 호중구에 의해 방출되지만 자가면역 질환 및 멸균 염증에도 중요한 역할을 합니다. 그들은 이중 가닥 DNA 필라멘트, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조입니다. 일단 방출되면 NET은 혈액과 조직에서 세포 외 병원체를 포획하여 죽일 수 있습니다. 또한 NET은 혈소판 부착 및 응고를 자극하여 항상성 조절에 참여합니다. 그러나 NET의 생산 조절 장애는 패혈증 또는 자가면역 질환을 포함한 다양한 질병과도 관련이 있어 치료 개입의 유망한 표적이 됩니다. 전자 현미경 외에도 면역 형광 이미징을 사용하여 NET을 시각화하는 것은 현재 조직에서 NET 상호 작용을 입증하는 유일한 알려진 방법 중 하나입니다. 따라서 NET을 시각화하기 위한 다양한 염색 방법이 활용되었습니다. 문헌에는 다양한 염색 프로토콜이 설명되어 있으며, 프로토콜 간에 높은 변동성을 보이는 네 가지 주요 구성 요소, 즉 (1) 사용된 항체 유형, (2) 자가형광 환원제의 사용, (3) 항원 회수 방법, (4) 투과성을 확인했습니다. 따라서 체외 면역형광 염색 프로토콜은 이 연구에서 다양한 종(마우스, 인간) 및 조직(피부, 장, 폐, 간, 심장, 척추 디스크)에 적용할 수 있도록 체계적으로 조정되고 개선되었습니다. 고정 및 파라핀 포매 후, 3μm 두께의 섹션을 슬라이드에 장착했습니다. 이 샘플은 수정된 염색 프로토콜에 따라 골수과산화효소(MPO), 시트룰린 히스톤 H3(H3cit) 및 호중구 엘라스타제(NE)에 대한 1차 항체로 염색되었습니다. 슬라이드를 2차 항체로 염색하고 광시야 형광 현미경을 사용하여 검사했습니다. 평가 시트에 따라 결과를 분석하고, 반정량적으로 차이를 기록했다.

여기에서는 다양한 조직에 적합한 최적화된 NET 염색 프로토콜을 제시합니다. H3cit 염색을 위해 새로운 1차 항체를 사용하고 자가형광 환원제로 비특이적 염색을 줄였습니다. 또한, NET 염색에는 일정한 고온과 신중한 시료 취급이 필요하다는 것을 입증했습니다.

서문

호중구 세포외 트랩(NETs)은 2004년 Brinkmann et al.에 의해 세포사멸 및 괴사와 다른 세포 사멸 경로로 처음 시각화되었습니다¹. 이 경로에서 호중구는 탈응축된 염색질을 세포 외 공간으로 방출하여 이전에 과립이나 세포질에 저장되었던 항균 단백질로 덮인 큰 거미줄 모양의 구조를 형성합니다. 이러한 항균 단백질에는 호중구 엘라스타제(ne), 골수화효소(MPO) 및 시트룰린 히스톤 H3(H3cit)가 포함되며, 이는 NET의 간접 면역형광 검출에 일반적으로 사용됩니다². 이 방법은 이러한 단백질의 정량적 존재를 식별할 뿐만 아니라; 실제로 NET과 유사한 구조를 구체적으로 감지할 수 있다는 장점이 있습니다. NET에서 언급된 단백질은 세포외 DNA와 함께 국소화되며, 이는 각 염색된 단백질과 세포외 DNA의 형광 신호의 중첩에 의해 검출될 수 있습니다. NET에서 세포외 DNA와 단백질의 공동 국소화로 인한 중첩 신호와 대조적으로, 온전한 호중구는 공동 국소화를 나타내지 않습니다. 여기서, NET 성분은 일반적으로 과립, 핵 및 세포질³에 별도로 저장된다.

첫 번째 발견 이후 NET은 수많은 질병, 특히....

프로토콜

이 연구에는 독일 함부르크의 Behörde für Justiz und Verbraucherschutz에 있는 함부르크 주 동물 연구국(Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)에서 승인한 실험에서 파생된 마우스 조직이 포함되었습니다(73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). 사용된 조직은 패혈증 모델의 쥐 폐와 결장과 화상을 입은 피부였습니다. 우리는 8주 된 수컷과 암컷 쥐를 사용했습니다. 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU는 모든 실험에 대해 준수되었습니다. 익명화된 인간 샘플에는 신생아 장염, 화상을 입은 피부, 담도 폐쇄증, 척추 디스크염 및 심근의 조직이 포함되었습니다. 함부르크 의학 연구 윤리 위원회(Medical Research Ethics Committee of Hamburg)에 따르면, 샘플은 정보에 입각한 동의가 필요하지 않았지만, 연구는 위원회의 승인을 받았다(WF-026/21).

1. 샘플 고정

1. Abu Abed 및 Brinkmann에서 파생된 다음 프로토콜을 샘플 고정, 탈수, 파라핀 임베....

토론

이 연구에서 우리는 실제 염색 과정부터 시작하여 NET을 이미징하기 위한 기존 프로토콜을 더 많은 조직 유형에 적용하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 가장 적합한 항체를 선택하는 것입니다. NE의 경우, 인간 조직에 대한 쥐 숙주의 NE 항체를 시험해 보았는데, 토끼 숙주의 NE에 비해 신뢰할 수 있는 염색이 없었습니다. 또한, Thålin et al.은 H3cit(R8)를 세포외 염.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M