Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Резюме

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) связаны с различными заболеваниями, и для их визуализации часто используется иммунофлуоресценция. Тем не менее, существуют различные протоколы окрашивания, и во многих случаях исследуется только один тип ткани. Здесь мы устанавливаем общеприменимый протокол для окрашивания НВЛ в тканях мышей и человека.

Аннотация

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) высвобождаются нейтрофилами в ответ на бактериальную инфекцию или травматическое повреждение тканей, но также играют роль в аутоиммунных заболеваниях и стерильном воспалении. Они представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из двухцепочечных нитей ДНК, гистонов и антимикробных белков. После высвобождения НВЛ могут захватывать и убивать внеклеточные патогены в крови и тканях. Кроме того, НВЛ участвуют в гомеостатической регуляции, стимулируя адгезию и коагуляцию тромбоцитов. Тем не менее, нарушение регуляции выработки НВЛ также связано с различными заболеваниями, включая сепсис или аутоиммунные расстройства, что делает их многообещающей мишенью для терапевтического вмешательства. Помимо электронной микроскопии, визуализация НВЛ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации в настоящее время является одним из немногих известных методов демонстрации НВЛ-взаимодействий в тканях. Поэтому для визуализации НЭО используются различные методы окрашивания. В литературе описаны различные протоколы окрашивания, и мы выделили четыре ключевых компонента, демонстрирующих высокую вариабельность между протоколами: (1) типы используемых антител, (2) использование аутофлюоресцентных редуцирующих агентов, (3) методы получения антигена и (4) пермеабилизация. Поэтому протоколы иммунофлюоресцентного окрашивания in vitro были системно адаптированы и усовершенствованы в данной работе, чтобы сделать их применимыми для различных видов (мышей, человека) и тканей (кожа, кишечник, легкие, печень, сердце, межпозвоночные диски). После фиксации и заделки парафином на предметные стекла были установлены секции толщиной 3 мкм. Эти образцы окрашивали первичными антителами к миелопероксидазе (МПО), цитруллинированному гистону Н3 (Н3цит) и нейтрофильной эластазе (НЭ) в соответствии с модифицированным протоколом окрашивания. Предметные стекла окрашивали вторичными антителами и исследовали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. Результаты анализировались в соответствии с оценочным листом, а различия фиксировались полуколичественно.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол окрашивания NET, подходящий для различных тканей. Мы использовали новое первичное антитело для окрашивания H3cit и уменьшали неспецифическое окрашивание с помощью аутофлуоресцентного редуцирующего агента. Кроме того, мы продемонстрировали, что окрашивание НЭТ требует постоянной высокой температуры и бережного обращения с образцами.

Введение

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004^году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет колич....

протокол

В это исследование были включены ткани мышей, полученные в ходе экспериментов, одобренных Гамбургским государственным управлением по исследованиям на животных, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Гамбург, Германия (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). В качестве тканей использовались мышиные легкие и толстая кишка из септической модели и обожженная кожа. Мы использовали 8-недельных самцов и самок мышей. Во всех экспериментах соблюдалась Европейская директива 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях. Обезличенные образцы человека включали ткани неонатального энтероколита, обожженной кожи, атрезию желчевыводящих путей, спондилодисцит и миокард....

Результаты

Прежде чем приступить к оптимизации протокола, мы определили ключевые шаги для успешного окрашивания, выполнив поиск в PubMed исследований, в которых ткань FFPE использовалась для иммуноокрашивания НВЛ, и сравнили их протоколы. Наиболее перспективные различия протоколов были определены в .......

Обсуждение

В этой работе мы стремились адаптировать и оптимизировать существующие протоколы визуализации НЭО для большего количества типов тканей, начиная с самого процесса окрашивания. Первым критическим шагом для этого метода является выбор наиболее подходящих антител. Для НЭ мы попробовали .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M