Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) связаны с различными заболеваниями, и для их визуализации часто используется иммунофлуоресценция. Тем не менее, существуют различные протоколы окрашивания, и во многих случаях исследуется только один тип ткани. Здесь мы устанавливаем общеприменимый протокол для окрашивания НВЛ в тканях мышей и человека.

Аннотация

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) высвобождаются нейтрофилами в ответ на бактериальную инфекцию или травматическое повреждение тканей, но также играют роль в аутоиммунных заболеваниях и стерильном воспалении. Они представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из двухцепочечных нитей ДНК, гистонов и антимикробных белков. После высвобождения НВЛ могут захватывать и убивать внеклеточные патогены в крови и тканях. Кроме того, НВЛ участвуют в гомеостатической регуляции, стимулируя адгезию и коагуляцию тромбоцитов. Тем не менее, нарушение регуляции выработки НВЛ также связано с различными заболеваниями, включая сепсис или аутоиммунные расстройства, что делает их многообещающей мишенью для терапевтического вмешательства. Помимо электронной микроскопии, визуализация НВЛ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации в настоящее время является одним из немногих известных методов демонстрации НВЛ-взаимодействий в тканях. Поэтому для визуализации НЭО используются различные методы окрашивания. В литературе описаны различные протоколы окрашивания, и мы выделили четыре ключевых компонента, демонстрирующих высокую вариабельность между протоколами: (1) типы используемых антител, (2) использование аутофлюоресцентных редуцирующих агентов, (3) методы получения антигена и (4) пермеабилизация. Поэтому протоколы иммунофлюоресцентного окрашивания in vitro были системно адаптированы и усовершенствованы в данной работе, чтобы сделать их применимыми для различных видов (мышей, человека) и тканей (кожа, кишечник, легкие, печень, сердце, межпозвоночные диски). После фиксации и заделки парафином на предметные стекла были установлены секции толщиной 3 мкм. Эти образцы окрашивали первичными антителами к миелопероксидазе (МПО), цитруллинированному гистону Н3 (Н3цит) и нейтрофильной эластазе (НЭ) в соответствии с модифицированным протоколом окрашивания. Предметные стекла окрашивали вторичными антителами и исследовали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. Результаты анализировались в соответствии с оценочным листом, а различия фиксировались полуколичественно.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол окрашивания NET, подходящий для различных тканей. Мы использовали новое первичное антитело для окрашивания H3cit и уменьшали неспецифическое окрашивание с помощью аутофлуоресцентного редуцирующего агента. Кроме того, мы продемонстрировали, что окрашивание НЭТ требует постоянной высокой температуры и бережного обращения с образцами.

Введение

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет колич....

протокол

В это исследование были включены ткани мышей, полученные в ходе экспериментов, одобренных Гамбургским государственным управлением по исследованиям на животных, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Гамбург, Германия (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). В качестве тканей использовались мышиные легкие и толстая кишка из септической модели и обожженная кожа. Мы использовали 8-недельных самцов и самок мышей. Во всех экспериментах соблюдалась Европейская директива 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях. Обезличенные образцы человека включали ткани неонатального энтероколита, обожженной кожи, атрезию желчевыводящих путей, спондилодисцит и миокард....

Результаты

Прежде чем приступить к оптимизации протокола, мы определили ключевые шаги для успешного окрашивания, выполнив поиск в PubMed исследований, в которых ткань FFPE использовалась для иммуноокрашивания НВЛ, и сравнили их протоколы. Наиболее перспективные различия протоколов были определены в .......

Обсуждение

В этой работе мы стремились адаптировать и оптимизировать существующие протоколы визуализации НЭО для большего количества типов тканей, начиная с самого процесса окрашивания. Первым критическим шагом для этого метода является выбор наиболее подходящих антител. Для НЭ мы попробовали .......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было основано Немецким научно-исследовательским обществом (BO5534). Мы благодарим Антонию Кивитт, Морица Ленца, Йоханну Хагенс, д-ра Аннику Хойер и приват-доцента д-ра Инго Кёнигса за предоставленные нам образцы. Кроме того, авторы благодарят команду Центра микроскопии УКЭ (Core facility, UKE Medical School) за поддержку в проведении иммунофлуоресцентной микроскопии.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
      Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µgabcamAb 68672 1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µgabcamAb 51031:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µgabcamAb 259891:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µgabcamAb 908101:50
Axiovision Microscopy Software Zeiss4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50mlGeneTex GTX30972
CoverslipsMarienfeld0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS antibody dilution 500 mLDCS diagnosticsDCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Donkey anti rabbit AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Donkey anti rabbit Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G Mounting MediumInvitrogen00-4958-02
Glass slide rackRothH552.1
Human/Mouse MPO AntibodyR&D SystemsAF 3667 1:20
Hydrophobic PenKISKERMKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mgabcamAb 374151:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
Microscopy cameraZeissAxioCamHR3
MicrowaveBoschHMT84M421
Mouse IgG1 negative controlDakoX0931 Aglient1:50 and 1:5
Normal Goat IgG ControlR&D SystemsAB-108-C 1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP staining jarRoth2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µgabcamAb 2194061:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µgabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth 6640
SuperFrost Plus slidesR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
Water bathMemmert830476
Water bath rice cookerreishungerRCP-30
Wet chamberWeckert Labortechnik600016
Zeiss Widefield microscopeZeissAxiovert 200M

Ссылки

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotect....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены