Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Резюме

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) связаны с различными заболеваниями, и для их визуализации часто используется иммунофлуоресценция. Тем не менее, существуют различные протоколы окрашивания, и во многих случаях исследуется только один тип ткани. Здесь мы устанавливаем общеприменимый протокол для окрашивания НВЛ в тканях мышей и человека.

Аннотация

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) высвобождаются нейтрофилами в ответ на бактериальную инфекцию или травматическое повреждение тканей, но также играют роль в аутоиммунных заболеваниях и стерильном воспалении. Они представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из двухцепочечных нитей ДНК, гистонов и антимикробных белков. После высвобождения НВЛ могут захватывать и убивать внеклеточные патогены в крови и тканях. Кроме того, НВЛ участвуют в гомеостатической регуляции, стимулируя адгезию и коагуляцию тромбоцитов. Тем не менее, нарушение регуляции выработки НВЛ также связано с различными заболеваниями, включая сепсис или аутоиммунные расстройства, что делает их многообещающей мишенью для терапевтического вмешательства. Помимо электронной микроскопии, визуализация НВЛ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации в настоящее время является одним из немногих известных методов демонстрации НВЛ-взаимодействий в тканях. Поэтому для визуализации НЭО используются различные методы окрашивания. В литературе описаны различные протоколы окрашивания, и мы выделили четыре ключевых компонента, демонстрирующих высокую вариабельность между протоколами: (1) типы используемых антител, (2) использование аутофлюоресцентных редуцирующих агентов, (3) методы получения антигена и (4) пермеабилизация. Поэтому протоколы иммунофлюоресцентного окрашивания in vitro были системно адаптированы и усовершенствованы в данной работе, чтобы сделать их применимыми для различных видов (мышей, человека) и тканей (кожа, кишечник, легкие, печень, сердце, межпозвоночные диски). После фиксации и заделки парафином на предметные стекла были установлены секции толщиной 3 мкм. Эти образцы окрашивали первичными антителами к миелопероксидазе (МПО), цитруллинированному гистону Н3 (Н3цит) и нейтрофильной эластазе (НЭ) в соответствии с модифицированным протоколом окрашивания. Предметные стекла окрашивали вторичными антителами и исследовали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. Результаты анализировались в соответствии с оценочным листом, а различия фиксировались полуколичественно.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол окрашивания NET, подходящий для различных тканей. Мы использовали новое первичное антитело для окрашивания H3cit и уменьшали неспецифическое окрашивание с помощью аутофлуоресцентного редуцирующего агента. Кроме того, мы продемонстрировали, что окрашивание НЭТ требует постоянной высокой температуры и бережного обращения с образцами.

Введение

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) были впервые визуализированы Brinkmann et al. как путь клеточной гибели, отличный от апоптоза и некроза в 2004^году. По этому пути нейтрофилы высвобождают свой деконденсированный хроматин во внеклеточное пространство, чтобы сформировать большие паутинчатые структуры, покрытые антимикробными белками, которые ранее хранились в гранулах или цитозоле. Эти антимикробные белки включают нейтрофильную эластазу (NE), миелопероксидазу (MPO) и цитруллинированный гистон H3 (H3cit), которые обычно используются для непрямой иммунофлуоресцентной детекции НВЛ-2. Этот метод не только определяет количественное присутствие этих белков; более того, его преимущество заключается в специфическом обнаружении NET-подобных структур. В НВЛ упомянутые белки локализуются с внеклеточной ДНК, что может быть обнаружено по перекрытию сигналов флуоресценции каждого окрашенного белка и внеклеточной ДНК. В отличие от перекрывающихся сигналов, обусловленных внеклеточной локализацией ДНК и белков в НВЛ, интактные нейтрофилы не демонстрируют колокализации. Здесь компоненты НВЛ обычно хранятся отдельно в гранулах, ядрах и цитозоле³.

С момента их первого открытия было показано, что НВЛ играют центральную роль во многих заболеваниях, особенно в тех, которые связаны с воспалением. НВЛ проявляют антимикробные функции во время инфекции путем захвата и уничтожения внеклеточных патогенов в крови и тканях ^4,5. Тем не менее, НВЛ также связаны с аутоиммунными заболеваниями и гипервоспалительными реакциями, такими как системная красная волчанка, ревматический артрит и аллергическая астма ^6,7,8. НВЛ способствуют вазоокклюзии и воспалению при атеросклерозе, адгезии тромбоцитов и, как предполагается, играют роль в развитии метастатического рака 9,10,11. Тем не менее, считается, что они обладают противовоспалительными свойствами, снижая уровень провоспалительных цитокинов¹². В то время как НЭО вызывают все больший интерес в более широкой области исследований, надежный метод обнаружения НЭО имеет фундаментальное значение для будущих исследований.

Несмотря на то, что визуализация НВЛ в различных тканях с помощью иммунофлуоресцентной визуализации сложна и требует адаптации, помимо электронной микроскопии, в настоящее время она является одним из наиболее известных методов визуализации взаимодействий между НВЛ и клетками и преимущественно используется в фиксированных формалином тканях, залитых парафином (FFPE)^13,14. Тем не менее, сравнение NET-изображений затруднено, так как разные лаборатории используют свои собственные индивидуальные протоколы. Эти протоколы отличаются использованием антител, методом извлечения антигена или пермеабилизации и часто оптимизированы для определенного типа тканей 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

После того, как Brinkmann et al. опубликовали первое методическое исследование с использованием иммунофлуоресцентной визуализации НВЛ в тканях FFPE, мы захотели оптимизировать этот протокол для более широкого спектра тканей и^видов15. Кроме того, чтобы создать широко применимый протокол иммунофлюоресценции, мы протестировали различные модифицированные протоколы исследований, в которых использовались методы иммунофлуоресценции в тканях FFPE для обнаружения НВЛ 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Кроме того, мы попробовали новое антитело H3cit для более специфического внеклеточного окрашивания²⁸. Мы предполагаем, что, систематически адаптируя существующие протоколы окрашивания к различным видам и тканям, визуализация in vitro может быть улучшена, что приведет к лучшему представлению взаимодействия между нейтрофилами и НВЛ как локально, так и системно.

протокол

В это исследование были включены ткани мышей, полученные в ходе экспериментов, одобренных Гамбургским государственным управлением по исследованиям на животных, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Гамбург, Германия (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). В качестве тканей использовались мышиные легкие и толстая кишка из септической модели и обожженная кожа. Мы использовали 8-недельных самцов и самок мышей. Во всех экспериментах соблюдалась Европейская директива 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях. Обезличенные образцы человека включали ткани неонатального энтероколита, обожженной кожи, атрезию желчевыводящих путей, спондилодисцит и миокард. По данным Комитета по этике медицинских исследований Гамбурга, образцы не требовали информированного согласия, но исследование было одобрено комитетом (WF-026/21).

1. Фиксация образца

1. Используйте следующий протокол, основанный на Абу Абеде и Бринкманне, для фиксации образца, обезвоживания, встраивания парафина, секционирования и монтажа ^3,15.
   1. Приготовьте 4% раствор формальдегида, растворив 40 г параформальдегида (PFA) в 800 мл трис-буферного физиологического раствора, pH 7,4 (TBS).
   2. Перемешайте смесь при температуре 60 °C под вытяжным шкафом до тех пор, пока PFA не растворится. Доведите раствор до комнатной температуры (RT) и отрегулируйте объем с помощью TBS до 1 000 мл.
   3. Отрегулируйте pH до 7,4. Хранить при температуре 4 °C в течение 2-3 недель или при температуре −20 °C в течение 1 года.
2. Для фиксации образца поместите свежую ткань в буфер TBS и разделите на кусочки размером менее 20 мм x 30 мм x 3 мм. Срезы тканей погружают в 4% раствор параформальдегида на 12-24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В оригинальном протоколе использовался 2% раствор PFA и время фиксации 8-20 ч. При этом методе некоторые срезы тканей не были полностью зафиксированы через 20 ч, поэтому концентрацию ПФА увеличивали до 4% ПФА.
3. Перенесите образцы в маркированные кассеты для обработки тканей. Для маркировки используйте маркеры или карандаши, устойчивые к растворителям.
4. Начните обезвоживание образца, погрузив затем кассеты в 70% этанол на 1 ч. Затем погрузите в 80% этанол, 90% этанол, 96% этанол и дважды в 100% этанол, каждый этап длится 1 час.
5. Дважды погрузить в 100% ксилол (диметилбензол), а затем дважды в парафин с температурой 60 °C на 1 ч каждый раз.
6. Используйте формы для встраивания для монтажа и дайте парафину затвердеть, прежде чем снимать форму.
7. Используйте микротом для вырезания срезов ткани толщиной 3 мкм.
8. С помощью пинцета положите срезы на водяную баню с температурой 37 °C и дайте им всплыть на поверхности, чтобы растянуть срезы ткани.
9. Поместите секции на клейкие предметные стекла (Таблица материалов) и дайте им высохнуть в течение ночи в термокамере с температурой 40 °C.

2. Регидратация образца

1. Для депарафинизации сложите предметные стекла в стойку для салазок и дважды погрузите на 5 минут каждый в замещающую среду лимонена ксилола (таблица материалов) и один раз на 5 минут в смесь лимонена и этанола 1:1.
   ВНИМАНИЕ: Лимонен легко воспламеняется при температуре 50 °C и может вызвать аллергические реакции. Используйте под вытяжным шкафом с защитными очками и перчатками. Беречь от открытого огня.
2. Регидратируйте образцы в нисходящей серии этанола, дважды погрузив ползунок в 100% этанол и один раз в 96% этанола, 90% этанола, 80% этанола и 70% этанола на 5 минут каждый.
3. Погрузите решетку на 5 минут в деионизированную воду (деионизированную воду), чтобы удалить оставшийся этанол.

3. Блокирование аутофлуоресценции и извлечение антигена

1. Приготовьте целевой раствор для извлечения цитрата pH 6 (TRS) (таблица материалов) в соответствии с техническим описанием. Этот TRS концентрируется в 10 раз. Поэтому разбавляйте 1:10 деионизированной водой. Разогрейте в пластиковой банке для окрашивания до 96 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TRS разрывает метиленовые мостики, образующиеся во время фиксации образца, чтобы обнажить эпитопы антигена. Это позволяет первичным антителам связываться со своим антигеном-мишенью. Хранить концентрированный TRS при температуре 2-8 °C в течение 8 месяцев. Всегда готовьте свежие TRS.
2. Выньте слайды из стойки и поместите их во влажную камеру. Нанесите пипеткой одну-две капли автофлуоресцентного восстановителя (таблица материалов) на каждый образец. Инкубировать 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аутофлюоресцентный редуцирующий агент блокирует присущую тканям автофлуоресценцию, вызванную эндогенными флуорофорами и фиксаторами. Храните автофлуоресцентно-восстановительный агент в RT до 1 года.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте только с небольшими участками тканей, чтобы избежать высыхания образцов или превышения времени инкубации.
3. Сложите предметные стекла обратно в стойку для слайдов и промойте в течение 1 минуты в 60% этаноле, используя движения вверх и вниз, пока не будет смыт весь неиспользованный реагент, снижающий автофлуоресценцию.
4. Погрузите решетку на 5 минут в деионизированную воду.
5. Для получения антигена перенесите предметные стекла в банку для окрашивания с предварительно нагретым TRS. Выдерживать 10 мин при температуре 96 °C на водяной бане.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Водяную баню с температурой 96 °C можно заменить микроволновой печью или пароваркой, если TRS предварительно нагрета до 96 °C и обеспечено 10-минутное время инкубации при 96 °C.
6. Выньте банку для окрашивания и дайте ей медленно остыть до RT в течение примерно 60-90 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь на срок до 4 часов, оставив слайды в TRS.
7. Снимите TRS, но оставьте предметные стекла в банке. Дважды промойте физраствором с трис-буфером 0,05% Tween (TBST, pH 7,4) в течение 3 минут каждый, чтобы смыть остатки TRS.
8. Для пермеабилизации приготовьте 0,2% Тритон в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, и залейте его в банку для окрашивания для пермеабилизации образцов в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пермеабилизация усиливает связывание первичных антител с внутриклеточными белками-мишенями в фиксированных образцах.
9. Промойте предметные стекла еще раз дважды в TBST по 3 минуты каждый раз.
10. Подготовьте влажную камеру, и уложите слайды. Вытрите излишки воды с предметных стекол бумажными салфетками. Обведите каждый образец гидрофобной барьерной ручкой, чтобы раствор антител не стекал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания образцов. Лучше всего работать с небольшими участками.

4. Блокирование связывания неспецифических антител

1. Возьмите готовый к применению блокирующий раствор с ослиной сывороткой (Таблица материалов) и капните пипеткой по одной капле на каждый образец. Инкубируйте в течение 30 мин при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап блокировки сводит к минимуму связывание вторичного антитела с неспецифическими сайтами связывания в образце. После блокирования этих неспецифических эпитопов и нанесения первичного антитела вторичное антитело будет связываться с первичным антителом и не взаимодействовать с поверхностью ткани. Готовый к применению блокирующий реагент хранится при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
2. Удалите излишки блокирующего раствора с предметных стекол, постукивая краем предметных стекол по твердой поверхности. Не смывайте их.

5. Первичные антитела

1. Первичные антитела разводят в буфере для разведения антител (Таблица материалов). Используйте примерно 100 мкл готового раствора для каждого образца. Для антител NE и H3cit (R8) и изоконтроля разбавляют до концентрации 5 мкг/мл. Для МПО и соответствующего изоконтроля используют 10 мкг/мл. Подготовьте по одной пробирке для каждого первичного антитела и по одной для каждого изоконтрольного антитела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: H3cit (R8)/MPO или NE/MPO и их изоконтроль можно комбинировать для окрашивания НЭО. Для комбинации H3cit (R8)/MPO разбавляют до конечной концентрации 5 мкг/мл для H3cit (R8) и 10 мкг/мл для MPO до конечного объема 100 мкл на образец. Для NE/MPO разбавляют до конечной концентрации 5 мкг/мл для NE и 10 мкг/мл для MPO до конечного объема 100 мкл на образец. Для изоконтроля используйте ту же концентрацию, что и для каждого соответствующего антитела. Всегда используйте новый наконечник для пипетки для каждого используемого антитела. Первичные антитела можно хранить при 4 °C в течение 1-2 недель и при −20 °C или −80 °C до 1 года.
2. Имея два образца на одном предметном стекле, используйте один для изоконтроля антител, а другой для разведения антител MPO/H3cit или MPO/NE. Используйте примерно 100 мкл для каждого образца и равномерно распределите раствор антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания образцов. Будьте осторожны, чтобы не перепутать изоконтроль и первичные антитела.
3. Хранить во влажной камере в течение ночи при температуре 4 °C.
4. На следующий день удалите излишки раствора первичных антител со слайдов и сложите их в кювету. Промыть три раза в течение 5 мин каждый раз TBST, чтобы смыть оставшийся раствор первичных антител.

6. Вторичные антитела

1. Приготовьте вторичный раствор антител. Используйте два разных флуоресцентных вторичных антитела: ослиный антикозий для МПО и ослиный антикроличий для окрашивания H3cit. Разбавьте каждый из них до концентрации 7,5 мкг/мл буфером для разведения антител (таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для двойного окрашивания используйте два флуоресцентных антитела с разными областями возбуждения и минимальным спектральным перекрытием. Объедините оба вторичных антитела и разбавьте до конечной концентрации 7,5 мкг/мл для каждого антитела для получения конечного объема 100 мкл на образец. Защищают антитела от света. Вторичные антитела могут храниться при 2-8 °C в течение 6-8 недель или при -80 °C до 1 года.
2. Храните предметные стекла во влажной камере и добавляйте 100 мкл раствора вторичных антител в каждый образец. Дайте им инкубироваться в течение 30 минут в защищенном от света месте.
3. Удалите излишки раствора вторичных антител и сложите предметные стекла в стойку для слайдов. Погрузите три раза на 5 минут каждый в банку для окрашивания, наполненную PBS, чтобы смыть оставшиеся несвязанные антитела.
4. Приготовьте раствор DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) (Таблица материалов) и разбавьте до концентрации 1 мкг/мл деионизированной водой. Погрузите штатив для показа в банку для окрашивания раствором DAPI и инкубируйте в течение 5 минут при RT в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI используется в качестве флуоресцентного красителя для двухцепочечной ДНК. Приготовленный раствор DAPI можно использовать многократно. Готовый раствор DAPI храните в RT. Концентрат DAPI можно хранить при температуре −20 °C до 1 года.
5. Погрузите решетку на 5 минут в банку для окрашивания с PBS, чтобы смыть излишки раствора DAPI.

7. Монтаж и хранение образцов, микроскопический анализ

1. Смонтируйте образцы с помощью покровных пластин и монтажной среды (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только небольшое количество монтажного средства и сотрите излишки среды влажными салфетками. Наденьте перчатки и избегайте случайного стирания каких-либо средств с покровных стекол или слайдов. Избегайте образования пузырьков и используйте ватные палочки, чтобы осторожно надавить на покровные стекла, чтобы удалить пузырьки с предметных стекол.
2. Для визуализации используют широкопольный микроскоп или конфокальный микроскоп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала сделайте снимок isocontrol. Уменьшите время экспозиции флуоресцентных фильтров (за исключением синего фильтра для DAPI) до тех пор, пока сигнал не будет обнаружен почти до конца. Затем используйте этот параметр для изучения соответствующих образцов. Ищите области, где флуоресцентный сигнал может быть обнаружен в каждом отдельном образце с помощью флуоресцентного канала. После получения изображения области программа генерирует составное изображение всех каналов и показывает различные сигналы флуоресценции в виде наложения разных цветов. Затем изображение может быть дополнительно проанализировано для совместной локализации с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как ImageJ.
3. Храните предметные стекла при температуре 4 °C до 6 месяцев.

Результаты

Прежде чем приступить к оптимизации протокола, мы определили ключевые шаги для успешного окрашивания, выполнив поиск в PubMed исследований, в которых ткань FFPE использовалась для иммуноокрашивания НВЛ, и сравнили их протоколы. Наиболее перспективные различия протоколов были определены в ...

Обсуждение

В этой работе мы стремились адаптировать и оптимизировать существующие протоколы визуализации НЭО для большего количества типов тканей, начиная с самого процесса окрашивания. Первым критическим шагом для этого метода является выбор наиболее подходящих антител. Для НЭ мы попробовали ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M