قياس الفلور الوظيفي الموجه للموقع في الخلايا الأصلية لدراسة استثارة العضلات الهيكلية

Summary

القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع هو طريقة لدراسة حركات مجال البروتين في الوقت الفعلي. يسمح تعديل هذه التقنية لتطبيقها في الخلايا الأصلية الآن باكتشاف وتتبع حركات مستشعر الجهد الفردي من قنوات Ca²⁺ ذات الجهد الكهربائي في ألياف العضلات الهيكلية المعزولة بالفئران.

Abstract

كان القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع هو التقنية المفضلة للتحقيق في العلاقة بين البنية والوظيفة للعديد من البروتينات الغشائية ، بما في ذلك القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي. تم استخدام هذا النهج في المقام الأول في أنظمة التعبير غير المتجانسة لقياس التيارات الغشائية في وقت واحد ، والمظاهر الكهربائية لنشاط القنوات ، وقياسات التألق ، والإبلاغ عن إعادة ترتيب المجال المحلي. يجمع القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع بين الفيزيولوجيا الكهربية والبيولوجيا الجزيئية والكيمياء والتألق في تقنية واحدة واسعة النطاق تسمح بدراسة عمليات إعادة الترتيب الهيكلية في الوقت الفعلي والوظيفة من خلال التألق والفيزيولوجيا الكهربية ، على التوالي. عادة ، يتطلب هذا النهج قناة غشاء مهندسة ذات بوابات الجهد تحتوي على سيستين يمكن اختباره بواسطة صبغة فلورية تفاعلية مع الثيول. حتى وقت قريب ، تم تنفيذ الكيمياء التفاعلية للثيول المستخدمة في وضع العلامات الفلورية الموجهة للموقع للبروتينات حصريا في بويضات Xenopus وخطوط الخلايا ، مما يحد من نطاق النهج إلى الخلايا الأولية غير القابلة للاستثارة. يصف هذا التقرير إمكانية تطبيق القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع في خلايا العضلات الهيكلية البالغة لدراسة الخطوات المبكرة لاقتران الإثارة والانكماش ، وهي العملية التي يرتبط بها إزالة الاستقطاب الكهربائي للألياف العضلية بتنشيط تقلص العضلات. يصف هذا البروتوكول منهجيات تصميم ونقل قنوات Ca² + المهندسة بالجهد (Ca_V1.1) إلى ألياف العضلات في المثنية الرقمية للفئران البالغة باستخدام التثقيب الكهربائي في الجسم الحي والخطوات اللاحقة المطلوبة لقياسات الفلور الوظيفية الموجهة للموقع. يمكن تكييف هذا النهج لدراسة القنوات الأيونية والبروتينات الأخرى. إن استخدام القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع لعضلات الثدييات له أهمية خاصة لدراسة الآليات الأساسية للإثارة.

Introduction

تعد القدرة على تتبع عمليات إعادة ترتيب مطابقة القناة الأيونية استجابة لمحفز كهربائي معروف في خلية حية مصدرا للمعلومات القيمة لعلم وظائف الأعضاء الجزيئي¹. القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد هي بروتينات غشائية تستشعر التغيرات في الجهد عبر الغشاء ، وتتأثر وظيفتها أيضا بتغيرات الجهد². سمح تطوير تقنيات مشبك الجهد في القرن الماضي لعلماء الفسيولوجيا بدراسة التيارات الأيونية التي تحملها القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد في الوقت الفعلي استجابة لإزالة استقطاب الغشاء³. كان استخدام تقنية مشبك الجهد أمرا حاسما في فهم الخصائص الكهربائية للخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية والعضلات. في سبعينيات القرن الع....

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة ميريلاند. تم تقسيم البروتوكول التالي إلى أقسام فرعية متعددة ، تتكون من (1) تصميم البناء الجزيئي واختيار صبغة تفاعل السيستين ، (2) التثقيب الكهربائي في الجسم الحي ، (3) تشريح العضلات وعزل الألياف ، (4) وصف إعداد الاستحواذ ، (5) تقييم النشاط الكهربائي الإيجابي للألياف الفلورية الخضراء المعززة (EGFP) وتلطيخ السيستين ، و (6) اكتساب الإشارات ومعالجتها. بالإضافة إلى ذلك ، في بداية كل قسم ، يتم تفصيل بعض الاعتبارات ذات الصلة عند تطبيق FSDF في الألياف العضلية الهيكلية. يجب تنفيذ جميع أقسام البروتوكول بمعدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.

النتائج

عندما يتم تشغيل إمكانات الفعل المنتشرة استجابة لتحفيز المجال المتكرر ، فمن الممكن تتبع حركة مستشعر الجهد المحددة استجابة لتردد معين من إزالة الاستقطاب. كما هو موضح في الشكل 6A ، يمكن تتبع حركة الحلزونات الموسومة VSD-II استجابة لكل من إزالة الاستقطاب المتتالية المطبقة عند 10 ه?.......

Discussion

هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء FSDF في ألياف العضلات لدراسة حركات مستشعر الجهد الفردي من قناة Ca_V1.1. على الرغم من أن عدد الخطوات وتنوع الأساليب التي يتم دمجها في هذه التقنية قد يبدو معقدا ، إلا أن معظم هذه التقنيات غالبا ما تستخدم بشكل روتيني في مختبرات الفيزياء الحيوية / علماء ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA