Fluorométrie fonctionnelle dirigée dans des cellules natives pour étudier l’excitabilité des muscles squelettiques

Résumé

La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site est une méthode permettant d’étudier les mouvements du domaine protéique en temps réel. La modification de cette technique pour son application dans les cellules natives permet maintenant la détection et le suivi des mouvements du capteur de tension unique à partir de canaux Ca²⁺ voltage-dépendants dans des fibres musculaires squelettiques isolées murines.

Résumé

La fluorométrie fonctionnelle dirigée vers le site a été la technique de choix pour étudier la relation structure-fonction de nombreuses protéines membranaires, y compris les canaux ioniques voltage-dépendants. Cette approche a été utilisée principalement dans les systèmes d’expression hétérologues pour mesurer simultanément les courants membranaires, la manifestation électrique de l’activité des canaux et les mesures de fluorescence, rapportant des réarrangements de domaine local. La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site combine l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la chimie et la fluorescence en une seule technique de grande envergure qui permet d’étudier les réarrangements structurels en temps réel et la fonction par fluorescence et électrophysiologie, respectivement. En règle générale, cette approche nécessite un canal membranaire voltage-dépendant qui contient une cystéine qui peut être testée par un colorant fluorescent thiol-réactif. Jusqu’à récemment, la chimie réactive aux thiols utilisée pour le marquage fluorescent dirigé des protéines était réalisée exclusivement dans les ovocytes et les lignées cellulaires Xenopus , limitant la portée de l’approche aux cellules primaires non excitables. Ce rapport décrit l’applicabilité de la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur le site dans les cellules musculaires squelettiques adultes pour étudier les premières étapes du couplage excitation-contraction, le processus par lequel la dépolarisation électrique des fibres musculaires est liée à l’activation de la contraction musculaire. Le présent protocole décrit les méthodologies de conception et de transfection des canaux Ca²⁺ voltage-dépendants modifiés par cystéine (Ca_V1.1) dans les fibres musculaires du fléchisseur digitorum brevis de souris adultes en utilisant l’électroporation in vivo et les étapes ultérieures requises pour les mesures fluorométriques fonctionnelles dirigées vers le site. Cette approche peut être adaptée pour étudier d’autres canaux ioniques et protéines. L’utilisation de la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur le site du muscle des mammifères est particulièrement pertinente pour étudier les mécanismes de base de l’excitabilité.

Introduction

La capacité de suivre les réarrangements conformationnels des canaux ioniques en réponse à un stimulus électrique connu dans une cellule vivante est une source d’informations précieuses pour la physiologie moléculaire¹. Les canaux ioniques voltage-dépendants sont des protéines membranaires qui détectent les changements de tension transmembranaire, et leur fonction est également affectée par les changements de tension². Le développement des techniques de pince de tension au siècle dernier a permis aux physiologistes d’étudier, en temps réel, les courants ioniques transportés par les canaux ioniques voltage-dépendants en r....

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Maryland. Le protocole suivant a été divisé en plusieurs sous-sections, comprenant (1) la conception de la construction moléculaire et la sélection du colorant réagissant à la cystéine, (2) l’électroporation in vivo , (3) la dissection musculaire et l’isolement des fibres, (4) la description de la configuration de l’acquisition, (5) l’évaluation de l’activité électrique positive améliorée de la protéine fluorescente verte (EGFP) et la coloration de la cystéine, et (6) l’acquisition et le traitement du signal. De plus, au début de chaque section, ce....

Discussion

Ici, un protocole étape par étape pour effectuer FSDF dans les fibres musculaires pour l’étude des mouvements individuels du capteur de tension du canal Ca_V1.1 est décrit. Même si le nombre d’étapes et la diversité des approches combinées dans cette technique peuvent sembler complexes, la plupart de ces techniques sont souvent couramment utilisées dans les laboratoires de biophysiciens et de biologistes cellulaires. Ainsi, la complexité apparente réside principalement dans la combinaison de tout.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA