פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

Summary

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca²⁺ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

Abstract

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר הייתה הטכניקה הנבחרת לחקור את יחסי מבנה-פונקציה של חלבוני ממברנה רבים, כולל תעלות יונים מגודרות מתח. גישה זו שימשה בעיקר במערכות ביטוי הטרולוגיות כדי למדוד בו זמנית זרמי ממברנה, את הביטוי החשמלי של פעילות התעלות, ומדידות פלואורסצנטיות, המדווחות על סידורים מחדש של תחומים מקומיים. פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר משלבת אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, כימיה ופלואורסצנטיות לטכניקה רחבה אחת המאפשרת לחקור סידורים מבניים בזמן אמת ותפקוד באמצעות פלואורסצנטיות ואלקטרופיזיולוגיה, בהתאמה. בדרך כלל, גישה זו דורשת תעלת ממברנה מגודרת מתח מהונדסת המכילה ציסטאין שניתן לבדוק על ידי צבע פלואורסצנטי תגובתי תיול. עד לאחרונה, הכימיה הריאקטיבית של תיול המשמשת לתיוג פלואורסצנטי מכוון אתר של חלבונים בוצעה אך ורק בביציות ובקווי תאים של קסנופוס , מה שהגביל את היקף הגישה לתאים ראשוניים שאינם מעוררים. דו"ח זה מתאר את היישום של פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שרירי שלד בוגרים כדי לחקור את השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת התכווצות שרירים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המתודולוגיות לתכנון והעברה של תעלות Ca²⁺ מגודרות מתח מהונדסות ציסטאין (Ca_V1.1) לסיבי שריר של flexor digitorum brevis של עכברים בוגרים באמצעות אלקטרופורציה in vivo ואת השלבים הבאים הדרושים למדידות פלואורומטריה פונקציונאליות מכוונות אתר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לחקר תעלות יונים וחלבונים אחרים. השימוש בפלאורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר של שרירי יונקים רלוונטי במיוחד לחקר מנגנונים בסיסיים של עוררות.

Introduction

היכולת לעקוב אחר סידורים קונפורמטיביים של תעלות יונים בתגובה לגירוי חשמלי ידוע בתא חי היא מקור למידע רב ערך עבור פיזיולוגיה מולקולרית¹. תעלות יונים מגודרות מתח הן חלבוני ממברנה החשים שינויים במתח הטרנסממברנלי, ותפקידם מושפע גם משינויי מתח². התפתחות טכניקות מהדק מתח במאה הקודמת אפשרה לפיזיולוגים לחקור, בזמן אמת, זרמים יוניים הנישאים על ידי תעלות יונים מגודרות מתח בתגובה לדפולריזציה של הממברנה³. השימוש בטכנולוגיית מהדק מתח היה חיוני להבנת התכונות החשמליות של תאים מעוררים כגון נוירונים ושרירים. בשנות ה-70 של המאה ה-20, עידון מהדק המתח איפשר זיהוי זרמי גאטינג (או תנועת מטען) בתעלות סידן מגודרות מתח (C....

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מרילנד. הפרוטוקול הבא חולק למספר תת-סעיפים, המורכבים (1) תכנון מבנה מולקולרי ובחירת צבע מגיב ציסטאין, (2) אלקטרופורציה in vivo , (3) דיסקציה של שרירים ובידוד סיבים, (4) תיאור מערך רכישה, (5) הערכה של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) פעילות חשמלית חיובית של סיבים וצביעת ציסטאין, ו-(6) רכישה ועיבוד של אותות. בנוסף, בתחילת כל סעיף מפורטים כמה שיקולים רלוונטיים בעת יישום FSDF בסיב שריר השלד. כל סעיפי הפרוטוקול צריכים להתבצע עם ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה וכפפות.

1. תכנון מבנה מולקולרי ובחירת צבע תגובת ציסטאין

1. תכנון מבנים ה....

תוצאות

כאשר פוטנציאלי פעולה מתפשטים מופעלים בתגובה לגירוי שדה חוזר, ניתן לעקוב אחר תנועת חיישן מתח ספציפי בתגובה לתדר מסוים של דפולריזציה. כפי שניתן לראות באיור 6A, ניתן לעקוב אחר התנועה של סלילים מתויגים VSD-II בתגובה לכל אחד משני דה-פולריזמים עוקבים המופעלים ב-10 הרץ (כלומר, ברווח של.......

Discussion

כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע FSDF בסיבי שריר לחקר תנועות חיישן מתח בודדות מערוץ Ca_V1.1. למרות שמספר השלבים ומגוון הגישות המשולבות בטכניקה זו עשויים להיראות מורכבים, רוב הטכניקות הללו משמשות לעתים קרובות באופן שגרתי במעבדות ביופיזיקאיות / ביולוגיות של התא. לפיכך, המורכבות לכאורה.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA