İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Özet

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca^{2 +} kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

Özet

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, voltaj kapılı iyon kanalları da dahil olmak üzere çok sayıda membran proteininin yapı-fonksiyon ilişkisini araştırmak için tercih edilen teknik olmuştur. Bu yaklaşım öncelikle heterolog ekspresyon sistemlerinde, membran akımlarını, kanalların aktivitesinin elektriksel tezahürünü ve floresan ölçümlerini eşzamanlı olarak ölçmek ve yerel alan yeniden düzenlemelerini raporlamak için kullanılmıştır. İşlevsel sahaya yönelik florometri, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, kimya ve floresanı, sırasıyla floresan ve elektrofizyoloji yoluyla gerçek zamanlı yapısal yeniden düzenlemelerin ve fonksiyonların incelenmesine izin veren tek bir geniş kapsamlı teknikte birleştirir. Tipik olarak, bu yaklaşım, bir tiol-reaktif floresan boya ile test edilebilen bir sistein içeren mühendislik voltaj kapılı bir membran kanalı gerektirir. Yakın zamana kadar, proteinlerin bölgeye yönelik floresan etiketlemesi için kullanılan tiol-reaktif kimya, yalnızca Xenopus oositlerinde ve hücre hatlarında gerçekleştirildi ve birincil uyarılamayan hücrelere yaklaşımın kapsamını kısıtladı. Bu raporda, yetişkin iskelet kası hücrelerinde fonksiyonel bölgeye yönelik florometrinin, kas lifi elektriksel depolarizasyonunun kas kasılmasının aktivasyonu ile bağlantılı olduğu süreç olan uyarılma-kasılma eşleşmesinin erken adımlarını incelemek için uygulanabilirliği açıklanmaktadır. Bu protokol, in vivo elektroporasyon kullanarak yetişkin farelerin fleksör digitorum brevis'inin kas liflerine sistein mühendisliği ile tasarlanmış voltaj kapılı Ca²⁺ kanallarını (Ca_V1.1) tasarlamak ve transfekte etmek için metodolojileri ve fonksiyonel bölgeye yönelik florometri ölçümleri için gerekli sonraki adımları açıklamaktadır. Bu yaklaşım diğer iyon kanallarını ve proteinleri incelemek için uyarlanabilir. Memeli kasının fonksiyonel bölgeye yönelik florometrisinin kullanımı, uyarılabilirliğin temel mekanizmalarını incelemek için özellikle önemlidir.

Giriş

Canlı bir hücrede bilinen bir elektriksel uyarana yanıt olarak iyon kanalı konformasyonel yeniden düzenlemelerini izleme yeteneği, moleküler fizyoloji¹ için değerli bir bilgi kaynağıdır. Voltaj kapılı iyon kanalları, transmembran voltajındaki değişiklikleri algılayan membran proteinleridir ve işlevleri voltaj değişimlerinden de etkilenir². Geçen yüzyılda voltaj kelepçesi tekniklerinin geliştirilmesi, fizyologların membran depolarizasyonuna yanıt olarak voltaj kapılı iyon kanalları tarafından taşınan iyonik akımları gerçek zamanlı olarak incelemelerine izin verdi³. Voltaj kelepçesi teknolojisinin k....

Protokol

Bu protokol Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki protokol, (1) moleküler yapı tasarımı ve sistein reaksiyona giren boya seçimi, (2) in vivo elektroporasyon, (3) kas diseksiyonu ve lif izolasyonu, (4) edinim kurulum tanımı, (5) gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) pozitif lif elektriksel aktivitesi ve sistein boyamasının değerlendirilmesi ve (6) sinyal edinimi ve işlenmesinden oluşan çoklu alt bölümlere ayrılmıştır. Ek olarak, her bölümün başında, FSDF'yi bir iskelet kası lifine uygularken bazı ilgili hususlar detaylandırılmıştır. Tüm protokol bölümleri, laboratuvar önlüğü ve eldivenleri de da....

Tartışmalar

Burada, Ca_V1.1 kanalından bireysel voltaj sensörü hareketlerinin incelenmesi için kas liflerinde FSDF'yi yürütmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Bu teknikte birleştirilen adımların sayısı ve yaklaşımların çeşitliliği karmaşık görünse de, bu tekniklerin çoğu genellikle biyofizikçi / hücre biyoloğu laboratuvarlarında rutin olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, görünen karmaşıklık, esas olarak, tüm çeşitli yaklaşımların tek bir entegre teknikte birleştir.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA