Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca²⁺ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

Zusammenfassung

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie war die Technik der Wahl, um die Struktur-Funktions-Beziehung zahlreicher Membranproteine, einschließlich spannungsabhängiger Ionenkanäle, zu untersuchen. Dieser Ansatz wurde vor allem in heterologen Expressionssystemen verwendet, um gleichzeitig Membranströme, die elektrische Manifestation der Kanalaktivität und Fluoreszenzmessungen zu messen und lokale Domänenumlagerungen zu melden. Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie kombiniert Elektrophysiologie, Molekularbiologie, Chemie und Fluoreszenz in einer einzigen, weitreichenden Technik, die es ermöglicht, strukturelle Umlagerungen und Funktionen durch Fluoreszenz bzw. Elektrophysiologie in Echtzeit zu untersuchen. In der Regel erfordert dieser Ansatz einen technisch hergestellten spannungsabhängigen Membrankanal, der ein Cystein enthält, das mit einem thiolreaktiven Fluoreszenzfarbstoff getestet werden kann. Bis vor kurzem wurde die Thiol-reaktive Chemie, die für die ortsgerichtete Fluoreszenzmarkierung von Proteinen verwendet wird, ausschließlich in Xenopus-Oozyten und Zelllinien durchgeführt, was den Anwendungsbereich des Ansatzes auf primäre, nicht erregbare Zellen einschränkte. Dieser Bericht beschreibt die Anwendbarkeit der funktionellen ortsgerichteten Fluorometrie in adulten Skelettmuskelzellen, um die frühen Schritte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung zu untersuchen, den Prozess, durch den die elektrische Depolarisation von Muskelfasern mit der Aktivierung der Muskelkontraktion verbunden ist. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methoden zum Design und zur Transfektion von Cystein-modifizierten spannungsabhängigen Ca²⁺ -Kanälen (Ca_V1.1) in Muskelfasern des Flexor digitorum brevis adulter Mäuse mittels in vivo Elektroporation und die nachfolgenden Schritte, die für funktionelle ortsgerichtete Fluorometriemessungen erforderlich sind. Dieser Ansatz kann angepasst werden, um andere Ionenkanäle und Proteine zu untersuchen. Der Einsatz der funktionellen ortsgerichteten Fluorometrie von Säugetiermuskeln ist besonders relevant für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Erregbarkeit.

Einleitung

Die Fähigkeit, Konformationsänderungen von Ionenkanälen als Reaktion auf einen bekannten elektrischen Reiz in einer lebenden Zelle zu verfolgen, ist eine Quelle wertvoller Informationen für die molekulare Physiologie¹. Spannungsabhängige Ionenkanäle sind Membranproteine, die Änderungen der Transmembranspannung wahrnehmen, und ihre Funktion wird auch durch Spannungsänderungen beeinflusst². Die Entwicklung von Spannungszangentechniken im letzten Jahrhundert ermöglichte es Physiologen, Ionenströme, die von spannungsabhängigen Ionenkanälen als Reaktion auf die Membrandepolarisation übertragen werden, in Echtzeit zu untersuch....

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Maryland genehmigt. Das folgende Protokoll wurde in mehrere Unterabschnitte unterteilt, bestehend aus (1) dem Design des molekularen Konstrukts und der Auswahl des Cystein-reagierenden Farbstoffs, (2) der In-vivo-Elektroporation , (3) der Muskeldissektion und Faserisolierung, (4) der Beschreibung des Erfassungsaufbaus, (5) der Bewertung der positiven elektrischen Faseraktivität des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) und der Cysteinfärbung sowie (6) der Signalerfassung und -verarbeitung. Darüber hinaus werden zu Beginn jedes Abschnitts einige relevante Überl....

Diskussion

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung von FSDF in Muskelfasern zur Untersuchung einzelner Spannungssensorbewegungen aus dem Ca_V1.1-Kanal beschrieben. Auch wenn die Anzahl der Schritte und die Vielfalt der Ansätze, die in dieser Technik kombiniert werden, komplex erscheinen mögen, werden die meisten dieser Techniken oft routinemäßig in Labors von Biophysikern/Zellbiologen eingesetzt. Die scheinbare Komplexität liegt also hauptsächlich in der Kombination all der verschiedenen Ansä.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA