Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

Riepilogo

La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca²⁺ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.

Abstract

La fluorometria funzionale sito-diretta è stata la tecnica scelta per studiare la relazione struttura-funzione di numerose proteine di membrana, compresi i canali ionici voltaggio-dipendenti. Questo approccio è stato utilizzato principalmente nei sistemi di espressione eterologa per misurare simultaneamente le correnti di membrana, la manifestazione elettrica dell'attività dei canali e le misurazioni di fluorescenza, riportando riarrangiamenti di dominio locale. La fluorometria funzionale diretta dal sito combina elettrofisiologia, biologia molecolare, chimica e fluorescenza in un'unica tecnica ad ampio raggio che consente lo studio dei riarrangiamenti strutturali in tempo reale e della funzione attraverso la fluorescenza e l'elettrofisiologia, rispettivamente. Tipicamente, questo approccio richiede un canale di membrana voltaggio-dipendente ingegnerizzato che contiene una cisteina che può essere testata da un colorante fluorescente tiolo-reattivo. Fino a poco tempo fa, la chimica tiolo-reattiva utilizzata per la marcatura fluorescente sito-diretta delle proteine veniva effettuata esclusivamente negli ovociti e nelle linee cellulari di Xenopus , limitando la portata dell'approccio alle cellule primarie non eccitabili. Questo rapporto descrive l'applicabilità della fluorometria funzionale sito-diretta nelle cellule muscolari scheletriche adulte per studiare le prime fasi dell'accoppiamento eccitazione-contrazione, il processo mediante il quale la depolarizzazione elettrica delle fibre muscolari è legata all'attivazione della contrazione muscolare. Il presente protocollo descrive le metodologie per progettare e trasfettare canali Ca²⁺ voltaggio-dipendenti ingegnerizzati con cisteina (Ca_V1.1) in fibre muscolari del flessore digitorum brevis di topi adulti utilizzando l'elettroporazione in vivo e le successive fasi richieste per le misure funzionali di fluorometria dirette al sito. Questo approccio può essere adattato per studiare altri canali ionici e proteine. L'uso della fluorometria funzionale sito-diretta del muscolo dei mammiferi è particolarmente rilevante per lo studio dei meccanismi di base dell'eccitabilità.

Introduzione

La capacità di tracciare i riarrangiamenti conformazionali dei canali ionici in risposta a uno stimolo elettrico noto in una cellula vivente è una fonte di informazioni preziose per la fisiologia molecolare¹. I canali ionici voltaggio-dipendenti sono proteine di membrana che rilevano i cambiamenti nella tensione transmembrana e la loro funzione è influenzata anche dalle variazioni di tensione². Lo sviluppo delle tecniche di tension-clamp nel secolo scorso ha permesso ai fisiologi di studiare, in tempo reale, le correnti ioniche trasportate dai canali ionici voltaggio-dipendenti in risposta alla depolarizzazione della mem....

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Maryland. Il seguente protocollo è stato suddiviso in più sottosezioni, consistenti in (1) progettazione del costrutto molecolare e selezione del colorante reagente della cisteina, (2) elettroporazione in vivo , (3) dissezione muscolare e isolamento delle fibre, (4) descrizione della configurazione dell'acquisizione, (5) valutazione dell'attività elettrica delle fibre positive della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) e colorazione della cisteina e (6) acquisizione ed elaborazione del segnale. Inoltre, all'inizio di ogni sezione, alcu....

Discussione

Qui viene descritto un protocollo passo-passo per condurre FSDF nelle fibre muscolari per lo studio dei singoli movimenti del sensore di tensione dal canale Ca_V1.1. Anche se il numero di passaggi e la diversità degli approcci che sono combinati in questa tecnica possono sembrare complessi, la maggior parte di queste tecniche sono spesso utilizzate di routine nei laboratori di biofisici / biologi cellulari. Pertanto, l'apparente complessità risiede principalmente nella combinazione di tutti i vari approcci in.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA