骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

要約

機能部位特異的蛍光法は、タンパク質ドメインの動きをリアルタイムで研究する方法です。天然細胞への適用のためのこの技術の修正は、マウス単離された骨格筋線維における電位依存性^Ca2+ チャネルからの単一の電圧センサ運動の検出および追跡を可能にするようになった。

要約

機能部位特異的蛍光法は、電位依存性イオンチャネルを含む多数の膜タンパク質の構造と機能の関係を調べるために選択された技術です。このアプローチは、主に異種発現システムで使用され、膜電流、チャネルの活性の電気的発現、および蛍光測定を同時に測定し、ローカルドメインの再配列を報告しています。機能部位特異的蛍光法は、電気生理学、分子生物学、化学、および蛍光を単一の幅広い技術に組み合わせ、蛍光と電気生理学によってそれぞれリアルタイムの構造再配列と機能の研究を可能にします。通常、このアプローチには、チオール反応性蛍光色素で試験できるシステインを含む、設計された電位依存性メンブレンチャネルが必要です。最近まで、タンパク質の部位特異的蛍光標識に使用されるチオール反応性化学は、アフリカツメガエル卵母細胞および細胞株でのみ行われていたため、初代非興奮性細胞へのアプローチの範囲が制限されていました。本報告では、筋線維の電気的脱分極が筋収縮の活性化と関連しているプロセスである興奮収縮結合の初期段階を研究するために、成人骨格筋細胞における機能部位特異的蛍光測定法の適用性について説明します。本プロトコルは、in vivoエレクトロポレーションおよび機能部位特異的蛍光測定に必要なその後のステップを用いて、システイン工学的電位依存性^Ca2+チャネル(Ca_V1.1)を成体マウスの指屈筋筋線維に設計およびトランスフェクトする方法論を説明する。このアプローチは、他のイオンチャネルやタンパク質の研究にも応用できます。哺乳類の筋肉の機能的な部位特異的蛍光法の使用は、興奮性の基本的なメカニズムの研究に特に関連しています。

概要

生細胞内の既知の電気刺激に応答してイオンチャネルの立体配座再配列を追跡する能力は、分子生理学にとって貴重な情報源です¹。電位依存性イオンチャネルは、膜貫通電圧の変化を感知する膜タンパク質であり、その機能は電圧変化によっても影響を受けます²。前世紀の電圧クランプ技術の開発により、生理学者は、膜の脱分極に応答して電位依存性イオンチャネルによって運ばれるイオン電流をリアルタイムで研究することができました³。電圧クランプ技術の使用は、ニューロンや筋肉などの興奮性細胞の電気的特性を理解する上で非常に重要です。1970年代には、電圧クランプの改良により、電位依存性カルシウム(Ca V)およびナトリウム(Na_V)チャネルのゲーティング電流(または電荷移動)の検出が可能になりました^4,5。ゲーティング電流は、細胞膜⁶を横切る電界の変化に応答した電圧センサの動きから生じる非線形容量性電流である。ゲーティング電流は、イオンチャネルの開口部に先行または付随する分子再^{配列の電気的}発現と見なされます7。これらの電流測定はチャネルの機能に関する貴重な情報を提供しま....

プロトコル

このプロトコルは、メリーランド大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。以下のプロトコルは、(1)分子構築物設計とシステイン反応色素の選択、(2) in vivo エレクトロポレーション、(3)筋解剖と線維分離、(4)取得セットアップの説明、(5)増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)陽性の繊維電気的活性とシステイン染色の評価、および(6)シグナルの取得と処理からなる複数のサブセクションに分かれています。さらに、各セクションの冒頭で、骨格筋線維にFSDFを適用する際のいくつかの関連する考慮事項について詳しく説明します。すべてのプロトコルセクションは、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を使用して実行する必要があります。

1. 分子構築設計とシステイン反応色素の選択

1. 構築設計は、実験の成功の重要な部分です。まず、野生型の蛍光タグ付きCa_V1.1 cDNAコンストラクトを作製し、適切な細胞型での発現を評価します。筋線維の場合、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを担持するプラスミドを使用することで、強力なトランスフェクション効率を達成できます。このプロトコルでは、既に特徴付けられたウサギEGFP-Ca_V1.1プラスミド³⁸を使用した。
   注:電位依存性イオンチャネルにシステイン残基を導入するよう....

ディスカッション

ここでは、Ca_V1.1チャネルからの個々の電圧センサーの動きを研究するために筋線維でFSDFを実施するための段階的なプロトコルについて説明します。この手法で組み合わされるステップ数とアプローチの多様性は複雑に見えるかもしれませんが、これらの手法のほとんどは、生物物理学者/細胞生物学者の研究室で日常的に使用されていることがよくあります。したがって、見かけの複.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA