골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

요약

기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca²⁺ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.

초록

기능적 부위 지정 형광 측정법은 전압 개폐 이온 채널을 포함한 수많은 막 단백질의 구조-기능 관계를 조사하기 위해 선택되는 기술이었습니다. 이 접근법은 주로 이종 발현 시스템에서 멤브레인 전류, 채널 활동의 전기적 발현 및 형광 측정을 동시에 측정하여 로컬 도메인 재배열을 보고하는 데 사용되었습니다. 기능적 부위 지정 형광 측정법은 전기 생리학, 분자 생물학, 화학 및 형광을 형광 및 전기 생리학을 통해 실시간 구조 재배열 및 기능을 연구할 수 있는 광범위한 단일 기술로 결합합니다. 일반적으로 이 접근 방식에는 티올 반응성 형광 염료로 테스트할 수 있는 시스테인을 포함하는 엔지니어링된 전압 개폐 멤브레인 채널이 필요합니다. 최근까지 단백질의 부위 지향 형광 표지에 사용된 티올 반응성 화학은 Xenopus 난모세포 및 세포주에서만 수행되어 1차 비흥분성 세포에 대한 접근 범위를 제한했습니다. 이 보고서는 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링의 초기 단계를 연구하기 위해 성인 골격근 세포에서 기능적 부위 지시 형광 측정법의 적용 가능성을 설명합니다. 본 프로토콜은 생체 내 전기천공을 사용하여 시스테인 공학 전압 개폐 Ca²⁺ 채널(Ca_V1.1)을 설계하고 성인 마우스의 굴근 손가락 브레비스의 근육 섬유로 형질감염시키는 방법론과 기능적 부위 지정 형광 측정 측정에 필요한 후속 단계를 설명합니다. 이 접근법은 다른 이온 채널과 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 포유류 근육의 기능적 부위 지정 형광 측정법의 사용은 특히 흥분성의 기본 메커니즘을 연구하는 것과 관련이 있습니다.

서문

살아있는 세포에서 알려진 전기적 자극에 대한 반응으로 이온 채널 구조적 재배열을 추적하는 능력은 분자 생리학에 대한 귀중한 정보의 원천입니다¹. 전압 개폐 이온 채널은 막횡단 전압의 변화를 감지하는 막 단백질이며, 그 기능도 전압 변화의 영향을 받습니다². 지난 세기의 전압 클램프 기술의 발전으로 생리학자들은 막 탈분극에 반응하여 전압 개폐 이온 채널에 의해 전달되는 이온 전류를 실시간으로 연구할 수 있었습니다³. 전압 클램프 기술의 사용은 뉴런 및 근육과 같은 흥분성 세포의 전기적 특성을 이해하는 데 중요했습니다. 1970년대에는 전압 클램프 미세 조정을 통해 전압 개폐 칼슘(Ca_V) 및 나트륨(_NaV) 채널 ^4,5에서 게이팅 전류(또는 전하 이동)를 감지할 수 있었습니다. 게이팅 전류는 세포막⁶을 가로지르는 전기장의 변화에 반응하여 전압 센서의 움직임에서 발생하는 비선형 용량성 전류입니다. 게이팅 전류는 이온 채널 개방⁷ 이전 또는 수....

프로토콜

이 프로토콜은 메릴랜드 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 다음 프로토콜은 (1) 분자 구조 설계 및 시스테인 반응 염료 선택, (2) 생체 내 전기천공, (3) 근육 해부 및 섬유 분리, (4) 획득 설정 설명, (5) 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 양성 섬유 전기 활성 및 시스테인 염색 평가, (6) 신호 획득 및 처리. 또한 각 섹션의 시작 부분에는 골격근 섬유에 FSDF를 적용할 때 몇 가지 관련 고려 사항이 자세히 설명되어 있습니다. 모든 프로토콜 섹션은 실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.

1. 분자 구조 설계 및 시스테인 반응 염료 선택

1. 구조 설계는 실험 성공의 중요한 부분입니다. 먼저, 야생형, 형광 태깅된 Ca_V1.1 cDNA 구축물을 생성하고, 적절한 세포 유형에서의 그의 발현을 평가한다. 근섬유의 경우, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 운반하는 플라스미드를 사용하여 강력한 형질감염 효율을 달성할 수 있다. 이 프로토콜에서, 이미 특성화된 토끼 EGFP-Ca_V1.1 플라스미드를 사용하였다(³⁸).

토론

여기서, Ca_V1.1 채널에서 개별 전압 센서 운동의 연구를 위해 근섬유에서 FSDF를 수행하는 단계별 프로토콜이 설명됩니다. 이 기술에 결합된 단계의 수와 접근 방식의 다양성이 복잡해 보일 수 있지만 이러한 기술의 대부분은 종종 생물 물리학자/세포 생물학자 실험실에서 일상적으로 사용됩니다. 따라서 겉보기 복잡성은 주로 단일 통합 기술에서 모든 다양한 접근 방식의 조합에 있습니다. .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA