Fluorometría funcional dirigida al sitio en células nativas para estudiar la excitabilidad del músculo esquelético

Resumen

La fluorometría funcional dirigida al sitio es un método para estudiar los movimientos del dominio de la proteína en tiempo real. La modificación de esta técnica para su aplicación en células nativas ahora permite la detección y el seguimiento de movimientos de un solo sensor de voltaje de canales Ca²⁺ dependientes de voltaje en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas.

Resumen

La fluorometría funcional dirigida al sitio ha sido la técnica elegida para investigar la relación estructura-función de numerosas proteínas de membrana, incluidos los canales iónicos dependientes de voltaje. Este enfoque se ha utilizado principalmente en sistemas de expresión heterólogos para medir simultáneamente las corrientes de membrana, la manifestación eléctrica de la actividad de los canales y las mediciones de fluorescencia, informando reordenamientos de dominio local. La fluorometría funcional dirigida al sitio combina electrofisiología, biología molecular, química y fluorescencia en una sola técnica de amplio alcance que permite el estudio de reordenamientos estructurales en tiempo real y la función a través de la fluorescencia y la electrofisiología, respectivamente. Por lo general, este enfoque requiere un canal de membrana dependiente de voltaje diseñado que contenga una cisteína que pueda ser probada por un tinte fluorescente reactivo al tiol. Hasta hace poco, la química tiol-reactiva utilizada para el marcado fluorescente dirigido al sitio de proteínas se llevaba a cabo exclusivamente en ovocitos y líneas celulares de Xenopus , restringiendo el alcance del enfoque a las células primarias no excitables. Este informe describe la aplicabilidad de la fluorometría funcional dirigida al sitio en células musculares esqueléticas adultas para estudiar los primeros pasos del acoplamiento excitación-contracción, el proceso por el cual la despolarización eléctrica de la fibra muscular está relacionada con la activación de la contracción muscular. El presente protocolo describe las metodologías para diseñar y transfectar canales de Ca²⁺ dependientes de voltaje diseñados con cisteína (Ca_V1.1) en fibras musculares del flexor digitorum brevis de ratones adultos utilizando electroporación in vivo y los pasos posteriores requeridos para mediciones funcionales de fluorometría dirigida al sitio. Este enfoque se puede adaptar para estudiar otros canales iónicos y proteínas. El uso de la fluorometría funcional dirigida al sitio del músculo de mamífero es particularmente relevante para estudiar los mecanismos básicos de excitabilidad.

Introducción

La capacidad de rastrear reordenamientos conformacionales del canal iónico en respuesta a un estímulo eléctrico conocido en una célula viva es una fuente de información valiosa para la fisiología molecular¹. Los canales iónicos dependientes de voltaje son proteínas de membrana que detectan cambios en el voltaje transmembrana, y su función también se ve afectada por los cambios de voltaje². El desarrollo de técnicas de pinza de voltaje en el siglo pasado permitió a los fisiólogos estudiar, en tiempo real, las corrientes iónicas transportadas por canales iónicos dependientes de voltaje en respuesta a la despolarización de ....

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland. El siguiente protocolo se ha dividido en múltiples subsecciones, que consisten en (1) diseño de constructo molecular y selección de colorante de reacción a cisteína, (2) electroporación in vivo , (3) disección muscular y aislamiento de fibras, (4) descripción de la configuración de adquisición, (5) evaluación de la actividad eléctrica de fibra positiva de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y tinción de cisteína, y (6) adquisición y procesamiento de señales. Además, al comienzo de cada sección, se detallan algunas consideraciones relevan....

Discusión

Aquí, se describe un protocolo paso a paso para realizar FSDF en fibras musculares para el estudio de movimientos individuales del sensor de voltaje del canal Ca_V1.1. Aunque el número de pasos y la diversidad de enfoques que se combinan en esta técnica pueden parecer complejos, la mayoría de estas técnicas a menudo se utilizan de forma rutinaria en laboratorios de biofísicos / biólogos celulares. Por lo tanto, la complejidad aparente reside principalmente en la combinación de todos los diversos enfoque.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA