天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

摘要

功能性定点荧光测定法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。该技术在天然细胞中的应用修改现在允许检测和跟踪来自小鼠分离骨骼肌纤维中电压门控Ca²⁺ 通道的单电压传感器运动。

摘要

功能性定点荧光测定法一直是研究许多膜蛋白（包括电压门控离子通道）的结构-功能关系的首选技术。这种方法主要用于异源表达系统，以同时测量膜电流、通道活性的电表现和荧光测量，报告局部结构域重排。功能性定点荧光测量将电生理学、分子生物学、化学和荧光结合到一个广泛的技术中，允许分别通过荧光和电生理学研究实时结构重排和功能。通常，这种方法需要一个工程电压门控膜通道，其中包含可以通过硫醇反应性荧光染料测试的半胱氨酸。直到最近，用于蛋白质的定点荧光标记的硫醇反应化学仅在非洲爪蟾卵母细胞和细胞系中进行，将该方法的范围限制在原代不可兴奋细胞上。本报告描述了功能性定点荧光测定法在成人骨骼肌细胞中的适用性，以研究激发-收缩耦合的早期步骤，即肌纤维电去极化与肌肉收缩激活相关的过程。本协议描述了使用体内电穿孔将半胱氨酸工程的电压门控Ca^{2 +}通道（Ca_V1.1）设计和转染到成年小鼠短指屈肌纤维中的方法，以及功能性定点荧光测量所需的后续步骤。这种方法可以适用于研究其他离子通道和蛋白质。使用哺乳动物肌肉的功能性定点荧光测定法与研究兴奋性的基本机制特别相关。

引言

响应活细胞中已知电刺激而跟踪离子通道构象重排的能力是分子生理学有价值的信息来源¹。电压门控离子通道是感知跨膜电压变化的膜蛋白，其功能也受^{电压变化的影响}2。上个世纪电压钳技术的发展使生理学家能够实时研究电压门控离子通道响应膜去极化而携带的离子电流³。电压钳技术的使用对于理解可兴奋细胞（如神经元和肌肉）的电特性至关重要。在 1970 年代，电压钳优化允许检测电压门控钙 （Ca V） 和钠 （Na_V） 通道^4，5 中的门控电流（或电荷移动）。门控电流是非线性电容电流，由电压传感器的运动产生，以响应细胞膜⁶上的电场变化。门控电流被认为是分子重排的电表现形式，在离子^{通道打开之前}或伴随7。虽然这些电流测量提供了有关通道功能的宝贵信息，但离子电流和门控电流都是电压门^控通道7的分子间和分子内构象重排的间接读数。

功能性定点荧光测定法（FSDF;也称为电压钳式荧光测定法，VCF）是在1990年代初开发的⁸....

研究方案

该协议已获得马里兰大学机构动物护理和使用委员会的批准。以下协议分为多个子部分，包括（1）分子构建体设计和半胱氨酸反应染料选择，（2） 体内 电穿孔，（3）肌肉解剖和纤维分离，（4）采集设置说明，（5）评估增强绿色荧光蛋白（EGFP）阳性纤维电活性和半胱氨酸染色，以及（6）信号采集和处理。此外，在每节的开头，在骨骼肌纤维中应用FSDF时，会详细介绍一些相关的注意事项。所有方案部分都应使用适当的个人防护设备进行，包括实验室外套和手套。

1. 分子构建体设计及半胱氨酸反应染料选择

1. 结构设计是实验成功的关键部分。首先，生成野生型荧光标记的 Ca_V1.1 cDNA 构建体，并评估其在适当细胞类型中的表达。对于肌纤维，通过使用携带巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒可以实现强大的转染效率。在该协议中，使用了已经表征的兔EGFP-Ca_V1.1质粒³⁸。
   注意：当设计cDNA构建体以将半胱氨酸残基引入电压门控离子通道时，半胱氨酸位置至关重要，应仔细考虑。半胱氨酸应可从细胞外空间进入，以允许硫醇偶联染料反应（图1C，D），并且应靠近S4区域以精确跟踪其响应去极化的运动。然而，为了允许染料荧光猝灭响应蛋白质运动，引入的半胱氨酸偶联荧光团应位....

讨论

本文描述了在肌纤维中进行FSDF的分步协议，以研究来自Ca_V1.1通道的单个电压传感器运动。尽管该技术中组合的步骤数量和方法的多样性可能看起来很复杂，但大多数这些技术通常用于生物物理学家/细胞生物学家实验室。因此，明显的复杂性主要在于将所有各种方法组合在一个单一的集成技术中。通常，在执行多步骤方法时，开始时进行的微小修改的影响只能在后续步骤的后面检测到。通.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA