مجموعة من تقنيات الفحص للحصول على نظرة عامة سريعة على وظيفة العدلات

Summary

يتميز هذا البروتوكول بمجموعة من المقايسات الوظيفية للعدلات لاستخدامها كطريقة فحص لتغطية الوظائف من مسارات الإشارات المختلفة. يتضمن البروتوكول تقييما أوليا وبسيطا لصلاحية الخلية ، والنقاء ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة ، واقتراح أولي لمصائد العدلات خارج الخلية.

Abstract

تعرف العدلات بأنها واحدة من خطوط الدفاع الأولى في الاستجابة المناعية الفطرية ويمكن أن تؤدي العديد من الوظائف الخلوية الخاصة ، مثل الانجذاب الكيميائي ، والهجرة العكسية ، والبلعمة ، وتحلل الإنزيمات السامة للخلايا والمستقلبات ، وإطلاق الحمض النووي كمصائد خارج الخلية للعدلات (NETs). لا تقوم العدلات بتنظيم الإشارات بإحكام فحسب ، بل تشارك أيضا في تنظيم المكونات الأخرى للجهاز المناعي. نظرا لأن العدلات الطازجة متباينة بشكل نهائي وقصيرة العمر ومتغيرة للغاية بين الأفراد ، فمن المهم تحقيق أقصى استفادة من العينات التي تم جمعها. غالبا ما يحتاج الباحثون إلى إجراء فحوصات الفحص لتقييم نظرة عامة على العديد من وظائف العدلات التي قد تتأثر بظروف معينة قيد التقييم. تم تطوير مجموعة من الاختبارات بعد عملية عزل واحدة للعدلات ذات الكثافة الطبيعية لتلبية هذه الحاجة ، سعيا لتحقيق التوازن بين السرعة والشمولية والتكلفة والدقة. يمكن استخدام النتائج لتبرير وتوجيه دراسات المتابعة المتعمقة. يمكن تنفيذ هذا الإجراء في متوسط وقت 4 ساعات ويتضمن تقييم صلاحية الخلية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة من الخميرة على الشرائح الزجاجية ، وترك خلايا كافية لنهج أكثر تفصيلا مثل دراسات omics. علاوة على ذلك ، يتضمن الإجراء طريقة لمراقبة اقتراح أولي للشبكات بسهولة بعد تلطيخ بانوبتيكي سريع لوحظ بواسطة المجهر الضوئي ، مع عدم وجود علامات محددة ، وإن كانت كافية للإشارة إلى ما إذا كان من المفيد بذل المزيد من الجهود بهذه الطريقة. يجمع تنوع الوظائف التي تم اختبارها بين النقاط المشتركة بين الاختبارات ، مما يقلل من وقت التحليل والنفقات. تم تسمية الإجراء باسم NeutroFun Screen ، وعلى الرغم من وجود قيود ، إلا أنه يوازن بين العوامل المذكورة أعلاه. علاوة على ذلك ، فإن الهدف من هذا العمل ليس مجموعة اختبار محددة ، بل هو مبدأ توجيهي يمكن تعديله بسهولة وفقا لموارد ومتطلبات كل مختبر.

Introduction

العدلات هي الخلايا المناعية الفطرية الأكثر وفرة في دم الإنسان ومن المعروف أنها تلعب دورا رئيسيا في العدوى والالتهابات ، كونها أول المستجيبين الذين يصلون إلى موقع تلف الأنسجة¹. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اعتراف متزايد بالدور الحاسم الذي تلعبه العدلات في مجموعة متنوعة من الأمراض وفي دعم التوازن². لا تقوم العدلات بتنظيم الإشارات بإحكام فحسب ، بل تشارك أيضا في تنظيم المكونات الأخرى للجهاز المناعي^3،4،5. لذلك ، فإن التحقيق في العدلات والعديد من وظائفها الخلوية غير العادية ، مثل الانجذاب الكيميائي ، والهجرة العكسية^....

Protocol

اتبعت جميع التجارب بدقة المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة برازيليا (العملية 13364819.0.0000.5558) ، وتم تحديد العينات بواسطة الرموز لضمان عدم الكشف عن هوية المانح. تم الحصول على الخلايا من متبرعين ذكور أصحاء طبيعيين تتراوح أعمارهم بين 18 و 35 عاما ، والذين وقعوا على الموافقة المستنيرة واستوفوا معايير الأهلية التالية: غير المدخنين / vapers ، ولا توجد حالات صحية مزمنة ، ولا يوجد تاريخ من الحالات الالتهابية في آخر 14 يوما.

1. جمع الدم

1. ضع 0.3 مل من 5000 وحدة دولية / مل من الهيبارين (انظر جدول المواد) في حقنة معقمة سعة 20 مل لتهقيمها.
2. ضع عاصبة وريدية حوالي....

النتائج

استوفت طريقة العزل القائمة على الكثافة المستخدمة في هذه الدراسة (الشكل 1) معايير التجارب المقترحة. تضمنت معلمات العدلات التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة الصلاحية ≥98٪ ، والنقاء ≥94٪ ، وإنتاجية الخلية ≥1.5 × 10⁷ ، مع عدم وجود تنشيط يمكن اكتشافه بواسطة اختبارات الفحص. خ?.......

Discussion

العدلات هي خلايا ديناميكية للغاية وسريعة الاستجابة وقصيرة العمر ولا يمكن حفظها بالتبريد^{حتى الآن 19} ، مما يجعل التحقيقات في بيولوجيتها صعبة. لذلك ، من الضروري اتباع خطوات دقيقة للحصول على العدلات القابلة للحياة والمخصبة والراحة^11,20. استخدمت هذه .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software