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この記事について

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  • 要約
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  • プロトコル
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  • 開示事項
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  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。

要約

好中球は、自然免疫応答における防御の最前線の1つとして知られており、走化性、逆遊走、食作用、細胞傷害性酵素および代謝産物の脱顆粒、好中球細胞外トラップ(NET)としてのDNAの放出など、多くの特定の細胞機能を実行することができます。好中球は、それ自体が厳密に制御されたシグナル伝達を持っているだけでなく、免疫系の他の構成要素の制御にも関与しています。新鮮な好中球は末期分化型で、寿命が短く、個人差が大きいため、採取したサンプルを最大限に活用することが重要です。研究者は、評価中の特定の条件によって影響を受ける可能性のある多くの好中球機能の概要を評価するために、スクリーニングアッセイを実施する必要があることがよくあります。このニーズに対応するために、正常密度好中球の単一の単離プロセスに続く一連のテストが開発され、速度、包括性、コスト、および精度のバランスが模索されました。この結果は、詳細な追跡調査の推論と指針として使用できます。この手順は平均4時間で実施でき、スライドガラス上での細胞生存率、活性酸素種(ROS)産生、リアルタイム移動、酵母の食作用の評価が含まれ、オミクス研究などのより詳細なアプローチに十分な細胞を残します。さらに、この手順には、光学顕微鏡で観察された高速パノプティック染色後のNETの予備的な提案を簡単に観察する方法が含まれていますが、特定のマーカーはありませんが、その方法でさらに努力する価値があるかどうかを示すのに十分です。テストする機能の多様性は、テスト間の共通点を組み合わせ、分析時間とコストを削減します。この手順はNeutroFun Screenと名付けられ、制限はありますが、前述の要素のバランスが取れています。さらに、この作業の目的は、明確なテストセットではなく、各ラボのリソースと要求に合わせて簡単に調整できるガイドラインです。

概要

好中球は、ヒトの血液中に最も多く存在する自然免疫細胞であり、感染や炎症に大きな役割を果たすことが知られており、組織損傷部位に最初に到達する応答者です1。近年、好中球がさまざまな疾患において、また恒常性維持(メオスタシス)を支える重要な役割を担っているという認識が高まっています2。好中球は、それ自体が厳密に制御されたシグナル伝達を持っているだけでなく、免疫系の他の構成要素の調節にも関与しています3,4,5。したがって、好中球と、走化性、逆遊走6、食作用7、呼吸バースト8、好中球細胞外トラップ(NET)7の放出など、好中球とその多くの異常な細胞機能を調べることは、分析中の特定の条件によって引き起こされる潜在的な好中球の機能的、形態学的、または分子的変化を評価する必要がある多くの研究状況で不可欠です。

単離されたばかりの好中球は、末端分化型で、寿命が短く、動的で、活性化しやすい....

プロトコル

すべての実験は、ブラジリア大学の治験審査委員会(プロセス13364819.0.0000.5558)によって設定された倫理ガイドラインに厳密に従い、サンプルはドナーの匿名性を確保するためのコードによって識別されました。細胞は、インフォームドコンセントに署名し、次の適格基準を満たした18〜35歳の正常な健康な男性ドナーから取得されました:非喫煙者/ベイパー、慢性的な健康状態なし、および過去14日間の炎症状態の病歴なし。

1.採血

  1. 0.3 mL の 5,000 IU/mL ヘパリン( 材料表を参照)を滅菌 20 mL シリンジに無菌的に入れてヘパリン化します。
  2. 穿刺部位の上に約4インチの静脈止血帯を適用し、静脈穿刺用の正中肘静脈または橈側静脈を特定します。
    注意: 止血帯の合計時間が1分を超えないようにしてください。
  3. 穿刺部位を70%アルコールで洗浄し、静脈穿刺を行います。
  4. 血液を採取した後、シリンジを3〜4回静かに反転させて、血液とヘパリンを適切に混合します。.

2. 好中球の単離

注:多形核白血球(PMN)は、密度勾配遠心分離とそれに続く残りの赤血球(RBC)の低張溶解によっ....

結果

この研究で使用した密度ベースの分離法(図1)は、提案された実験の基準を満たしていました。この方法から得られた好中球パラメータには、生存率≥98%、純度≥94%、および細胞収量≥1.5 x 107が含まれていましたが、スクリーニングテストでは検出可能な活性化はありませんでした。PMNの単離における2つの関連するステップは、抗凝固療法と赤血球除去です。抗?.......

ディスカッション

好中球は非常に動的で応答性の高い細胞であり、寿命が短く、まだ凍結保存できないため19、その生物学の調査は困難です。したがって、生存可能で濃縮された安静中の好中球を得るためには、慎重な手順に従うことが不可欠です11,20。この研究では、穏やかで最小限の操作と、活性化ステップまでの低温の使用に重点を置いた密?.......

開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP、およびFINATECの助成機関に謝意を表します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CIM-Plate 16Agilent 5665825001
CLARIOstar Plate Reader BMG LABTECHUS Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxideDinâmica1582
DNAse ISigma - AldrichDN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateSigma - AldrichE5134
Fast panoptic stainLaborclin620529
Glass slideExacta7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.Sigma - Aldrich55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 7896014655229
Laminar flow cabinetVecoVLFS-12
MicroscopeZeiss415501-0101-002Product details: Primostar 1
Mixing BlockBIOERMB-102
Neubauer improved bright-linedNew Optik1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanineSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma - AldrichP8139
Phosphate buffered saline tabletSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Sodium dodecyl sulfateCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Trypan blue solutionVetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)Agilent 380601050Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

参考文献

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life S....

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