Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол включает в себя набор функциональных анализов нейтрофилов, которые будут использоваться в качестве метода скрининга для охвата функций различных сигнальных путей. Протокол включает в себя первичную и простую оценку жизнеспособности, чистоты, продукции активных форм кислорода, миграцию в реальном времени, фагоцитоз и предварительное предложение внеклеточных ловушек нейтрофилов.

Аннотация

Нейтрофилы известны как одна из первых линий защиты в врожденном иммунном ответе и могут выполнять многие специфические клеточные функции, такие как хемотаксис, обратная миграция, фагоцитоз, дегрануляция цитотоксических ферментов и метаболитов и высвобождение ДНК в виде внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ). Нейтрофилы не только жестко регулируют сигнализацию, но и участвуют в регуляции других компонентов иммунной системы. Поскольку свежие нейтрофилы терминально дифференцированы, недолговечны и сильно изменчивы у разных людей, важно максимально использовать собранные образцы. Исследователям часто необходимо проводить скрининговые анализы, чтобы оценить обзор многих функций нейтрофилов, на которые могут влиять конкретные оцениваемые условия. Для удовлетворения этой потребности был разработан набор тестов, следующих за единым процессом выделения нейтрофилов нормальной плотности, в поисках баланса между скоростью, полнотой, стоимостью и точностью. Полученные результаты могут быть использованы для обоснования и руководства последующими углубленными исследованиями. Эта процедура может быть проведена в среднем за 4 часа и включает в себя оценку жизнеспособности клеток, продукцию активных форм кислорода (АФК), миграцию в реальном времени и фагоцитоз дрожжей на предметных стеклах, оставляя достаточное количество клеток для более детальных подходов, таких как омиксные исследования. Кроме того, процедура включает в себя способ легко наблюдать предварительное предположение НВЛ после быстрого паноптического окрашивания, наблюдаемого с помощью световой микроскопии, при отсутствии специфических маркеров, хотя и достаточных, чтобы указать, стоит ли прилагать дальнейшие усилия в этом направлении. Разнообразие тестируемых функций объединяет общие моменты между тестами, сокращая время и затраты на анализ. Процедура получила название NeutroFun Screen, и хотя у нее есть ограничения, она уравновешивает вышеупомянутые факторы. Кроме того, целью этой работы является не определенный набор тестов, а скорее руководство, которое может быть легко адаптировано к ресурсам и потребностям каждой лаборатории.

Введение

Нейтрофилы являются наиболее распространенными клетками врожденного иммунитета в крови человека и, как известно, играют важную роль в инфекции и воспалении, являясь первыми реагирующими наместо повреждения тканей. В последние годы растет признание решающей роли, которую нейтрофилы играют при различных заболеваниях и в поддержании гомеостаза2. Нейтрофилы не только обладают жестко регулируемой сигнализацией, но и участвуют в регуляции других компонентов иммунной системы 3,4,5. Таким образом, изучение нейтрофилов и их многочисленны....

протокол

Все эксперименты строго следовали этическим принципам, установленным институциональным наблюдательным советом Университета Бразилиа (процесс 13364819.0.0000.5558), а образцы были идентифицированы кодами для обеспечения анонимности доноров. Клетки были получены от нормальных здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-35 лет, которые подписали информированное согласие и соответствовали следующим критериям приемлемости: некурящие/вейперы, отсутствие хронических заболеваний и отсутствие воспалительных состояний в анамнезе в течение последних 14 дней.

1. Забор крови

  1. Асептически помещают 0,3 мл гепарина 5 000 МЕ/мл (см.

Результаты

Метод изоляции по плотности, использованный в данном исследовании (рис. 1), соответствовал критериям предложенных экспериментов. Параметры нейтрофилов, полученные с помощью этого метода, включали жизнеспособность ≥98%, чистоту ≥94%) и выход клеток ≥1,5 x 107, при этом а?.......

Обсуждение

Нейтрофилы являются очень динамичными и чувствительными клетками, которые недолговечны и еще не могут быть криоконсервированы, что затрудняет изучение их биологии. Поэтому необходимо соблюдать осторожные шаги для получения жизнеспособных, обогащенных и покоящихся нейт?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность следующим финансирующим организациям: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP и FINATEC.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CIM-Plate 16Agilent 5665825001
CLARIOstar Plate Reader BMG LABTECHUS Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxideDinâmica1582
DNAse ISigma - AldrichDN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateSigma - AldrichE5134
Fast panoptic stainLaborclin620529
Glass slideExacta7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.Sigma - Aldrich55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 7896014655229
Laminar flow cabinetVecoVLFS-12
MicroscopeZeiss415501-0101-002Product details: Primostar 1
Mixing BlockBIOERMB-102
Neubauer improved bright-linedNew Optik1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanineSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma - AldrichP8139
Phosphate buffered saline tabletSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Sodium dodecyl sulfateCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Trypan blue solutionVetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)Agilent 380601050Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

Ссылки

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life S....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены