Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Resumo

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Resumo

Os neutrófilos são conhecidos como uma das primeiras linhas de defesa da resposta imune inata e podem desempenhar muitas funções celulares particulares, como quimiotaxia, migração reversa, fagocitose, degranulação de enzimas e metabólitos citotóxicos e liberação de DNA como armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imunológico. Como os neutrófilos frescos são terminalmente diferenciados, de curta duração e altamente variáveis entre os indivíduos, é importante aproveitar ao máximo as amostras coletadas. Os pesquisadores muitas vezes precisam realizar ensaios de triagem para avaliar uma visão geral das muitas funções dos neutrófilos que podem ser afetadas por condições específicas sob avaliação. Um conjunto de testes seguindo um único processo de isolamento de neutrófilos de densidade normal foi desenvolvido para atender a essa necessidade, buscando um equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e acurácia. Os resultados podem ser usados para fundamentar e orientar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento pode ser realizado em um tempo médio de 4 h e inclui a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de leveduras em lâminas de vidro, deixando células suficientes para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. Além disso, o procedimento inclui uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de TNEs após coloração panóptica rápida observada por microscopia de luz, com falta de marcadores específicos, embora suficientes para indicar se esforços adicionais nesse sentido valeriam a pena. A diversidade de funções testadas combina pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo e os gastos da análise. O procedimento foi denominado NeutroFun Screen e, apesar de apresentar limitações, equilibra os fatores supracitados. Além disso, o objetivo deste trabalho não é um conjunto de testes definido, mas sim uma diretriz que possa ser facilmente ajustada aos recursos e demandas de cada laboratório.

Introdução

Os neutrófilos são as células imunes inatas mais abundantes no sangue humano e são conhecidos por desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, sendo os primeiros respondedores a chegar ao local do dano tecidual¹. Nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento do papel crucial que os neutrófilos desempenham em uma variedade de doenças e no suporte da homeostase². Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imune ^3,4,5. Portan....

Protocolo

Todos os experimentos seguiram rigorosamente as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Brasília (processo 13364819.0.0000.5558), e as amostras foram identificadas por códigos para garantir o anonimato dos doadores. As células foram obtidas de doadores normais do sexo masculino, saudáveis, com idade entre 18 e 35 anos, que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e preencheram os seguintes critérios de elegibilidade: não fumantes/vapers, sem condições crônicas de saúde e sem história de condições inflamatórias nos últimos 14 dias.

1. Coleta de sangue

1. Coloqu....

Resultados

O método de isolamento baseado em densidade utilizado neste estudo (Figura 1) atendeu aos critérios para os experimentos propostos. Os parâmetros neutrófilos obtidos por esse método incluíram viabilidade ≥98%, pureza ≥94% e rendimento celular ≥1,5 x 10⁷, sem ativação detectável pelos testes de triagem. Duas etapas relevantes no isolamento dos PMNs são a anticoagulação e a remoção das hemácias. Manter o tubo de sangue anticoagulado ou a seringa em um balanço s.......

Discussão

Os neutrófilos são células altamente dinâmicas e responsivas, de curta duração e ainda não podem ser criopreservados¹⁹, o que torna as investigações sobre sua biologia desafiadoras. Portanto, é essencial seguir passos cuidadosos para obter neutrófilos viáveis, enriquecidos e em repouso^11,20. Este estudo empregou uma técnica de isolamento baseada em densidade que enfatiza a manipulação suave e mínima, bem como o uso de baixa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software