סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

Summary

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

Abstract

נויטרופילים ידועים כאחד מקווי ההגנה הראשונים בתגובה החיסונית המולדת ויכולים לבצע תפקודים תאיים מסוימים רבים, כגון כימוטקסיס, הגירה הפוכה, פגוציטוזה, פירוק אנזימים ציטוטוקסיים ומטבוליטים, ושחרור דנ"א כמלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית. מכיוון שנויטרופילים טריים נבדלים זה מזה, קצרי חיים ומשתנים מאוד בין אנשים, חשוב להפיק את המרב מהדגימות שנאספו. חוקרים לעתים קרובות צריכים לבצע בדיקות סקר כדי להעריך סקירה כללית של פונקציות נויטרופילים רבים שעשויים להיות מושפעים מתנאים ספציפיים תחת הערכה. סדרה של בדיקות בעקבות תהליך בידוד יחיד של נויטרופילים בצפיפות נורמלית פותחה כדי לענות על צורך זה, בחיפוש אחר איזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק. התוצאות יכולות לשמש כדי לנמק ולהנחות מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה יכול להתבצע בזמן ממוצע של 4 שעות וכולל הערכה של כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרים על שקופיות זכוכית, מה שמשאיר מספיק תאים לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתר על כן, ההליך כולל דרך לצפות בקלות בהצעה ראשונית של NETs לאחר צביעה פנאופטית מהירה שנצפתה במיקרוסקופ אור, עם היעדר סמנים ספציפיים, אם כי מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בדרך זו יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו משלב נקודות משותפות בין הבדיקות, ומקטין את זמן הניתוח וההוצאות. ההליך נקרא NeutroFun Screen, ולמרות שיש לו מגבלות, הוא מאזן את הגורמים הנ"ל. יתר על כן, מטרת עבודה זו אינה סט בדיקות מוגדר, אלא קו מנחה שניתן להתאים בקלות למשאבים ולדרישות של כל מעבדה.

Introduction

נויטרופילים הם תאי החיסון המולדים הנפוצים ביותר בדם האנושי וידועים כממלאים תפקיד מרכזי בזיהום ובדלקת, בהיותם המגיבים הראשונים שהגיעו לאתר של נזק לרקמות¹. בשנים האחרונות גוברת ההכרה בתפקיד המכריע שממלאים נויטרופילים במגוון מחלות ובתמיכה בהומאוסטזיס². נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית ^3,4,5. לכן, חקירת נויטרופילים ותפקודיהם התאיים יוצאי הדופן הרבים, כגון כימוטקסיס, נדידה הפוכה⁶, פגוציטוזה⁷, התפרצות נשימתית⁸ ושחרור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs)⁷, היא הכרחית בהקשרים מחקריים רבים שבהם יש צורך להעריך את השינויים הפונקציונליים, המורפולוגיים או המולקולריים הפוטנציאליים של נויטרופילים המופעלים על ידי תנאים ספציפיים הנבדקים.

נויטרופילים מבודדים טריים הם בעלי התמיינות סופנית, קצרי מועד, דינמיים מאוד ומופעלים בקלות⁹. עם זאת, שיטת אחסון יעילה שאינה משפיעה על תגובות הנויטרופילים טרם הושגה, מה שהופך את ביצוע בדיקות מרובות למאתגרות שחייבות להיות רצופות. יתר על כן, ניתוחים פונקציונליים^10,11 שתוארו קודם לכן, המבוססים על בדיקות הדורשות ציטומטריה ו / או צביעה פלואורסצנטית, עשויים שלא להיות בחירה מעשית כאשר יש צורך בהערכה רחבה וראשונית של הנויטרופיל.

כדי לטפל בבעיות אלה, פרוטוקול זה מתאר סדרה של בדיקות שניתן לבצע לאחר תהליך בידוד יחיד, כולל הערכת כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), שתוצאותיהם יכולות לשמש להנמקת מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה, שנקרא NeutroFun Screen, תוכנן להקיף את פעילויות האפקט המובילות, למעט degranulation, וניתן להשלים בזמן ממוצע של 4 שעות, כולל 1 שעה של הפעלה. בנוסף, התאים הנותרים יכולים לשמש לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתרונה של שיטה זו טמון באיזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק.

יתר על כן, יש דרך להתבונן בקלות בהצעה ראשונית של NETs, ללא סמנים ספציפיים, אך מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בכיוון זה יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו נועד לשלב נקודות משותפות בין המבחנים, ולצמצם את זמן הניתוח וההוצאות. המטרה העיקרית של שיטה זו היא לספק ניתוח מאוזן ופונקציונלי לגבי מהירות, מקיף, עלות ודיוק המאפשר סקירה כללית של תגובת הנויטרופילים, מה שהופך אותה לצעד ראשוני שימושי בחקירת ההשפעות של גירויים חדשים על נויטרופילים בצפיפות נורמלית.

Protocol

כל הניסויים עקבו בקפדנות אחר ההנחיות האתיות שנקבעו על ידי ועדת הביקורת המוסדית באוניברסיטת ברזיליה (תהליך 13364819.0.0000.5558), והדגימות זוהו על ידי קודים כדי להבטיח את אנונימיות התורם. התאים נלקחו מתורמים זכרים בריאים רגילים בגילאי 18-35 שנים, שחתמו על ההסכמה מדעת ועמדו בתנאי הזכאות הבאים: לא מעשנים/מאדים, ללא מחלות כרוניות וללא היסטוריה של מצבים דלקתיים ב-14 הימים האחרונים.

1. איסוף דם

1. יש להניח 0.3 מ"ל של 5,000 IU/mL הפרין (ראה טבלת חומרים) במזרק סטרילי של 20 מ"ל כדי להפריד אותו.
2. יש למרוח חוסם עורקים ורידי כ-12 ס"מ מעל אתר הניקוב ולזהות את הווריד הקוביטלי החציוני או הווריד הצפלי לניקוב.
   הערה: יש לוודא שזמן חוסם העורקים הכולל אינו עולה על דקה.
3. נקו את אתר הניקוב עם 70% אלכוהול ובצעו את הניקוב.
4. הפוך בעדינות את המזרק שלוש או ארבע פעמים לאחר איסוף הדם כדי לערבב את הדם ואת הפרין כראוי.

2. בידוד נויטרופילים

הערה: לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMNs) מבודדים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ואחריה ליזה היפוטונית של תאי הדם האדומים הנותרים (RBC), כפי שתואר קודם לכן¹¹ עם כמה שינויים. שיטה זו אינה חובה לביצוע בדיקות המיון, וניתן להחליפה כל עוד השיטה שנבחרה מביאה לכדאיות של >97%, פרימה או הפעלה של <3% מה- PMNs, ומניבה מספיק תאים לכל הבדיקות, ההעתקים והתנאים. ביצוע שלבים אלה בתנאים אספטיים ושימוש בתמיסות נטולות אנדוטוקסין הם חובה כדי למנוע הפעלת תאים.

1. בצע דילול של 12 מ"ל של חומרי הפרדה של 60% ו-70% (זמין מסחרית; ראה טבלת חומרים) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
2. מכינים את השיפוע מלמטה למעלה על ידי הוספת 4 מ"ל בכל פעם של דילול של 60% מעל דילול של 70%, באמצעות פיפטה של 5 מ"ל. עשה זאת בעדינות כדי למנוע ערבוב הממשק.
3. בזהירות שכבה 12 מ"ל של דם heparinized על גבי שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: משלב זה ואילך, עד להפעלת PMN, יש לשמור את כל הריאגנטים והצינורות המשמשים בצידנית מלאה בקרח.
4. השליכו את שכבת הפלזמה/תא חד-גרעיני, ולאחר מכן העבירו בעדינות את השכבה שמעל גלולת כדורית כדורית הדם לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל עם כ-7.5 מ"ל בכל אחד. הרכיבו את נפח הצינור עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS; ראו טבלת חומרים).
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 19 ° C.
6. שטפו את גלולת התא עם HBSS.
   1. השליכו את הסופרנאטנט על ידי מזיגת הצינור והשהו מחדש בעדינות את הגלולה ב-7 מ"ל HBSS.
   2. צנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב-19°C להסרת כל אמצעי ההפרדה.
7. בצע ליזה היפוטונית של RBCs הנותרים.
   1. יש להשליך את הסופרנאטנט ולערבב את הכדוריות בצינור אחד.
   2. השהה מחדש את גלולת RBC/PMN ב-3 מ"ל של H₂O סטרילי והוסף 3 מ"ל HBSS (2x) תוך 25 שניות כדי לשחזר את האוסמולריות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 19 ° C.
   3. חזור על שלבים 2.8.1 ו- 2.8.2 לקבלת גלולה לבנה ללא אריתרוציטים.
      הערה: יש להסיר את הסופרנאטנט בהקדם האפשרי כדי למזער את המגע של נויטרופילים עם תוצרי פירוק RBC. לחלופין, ניתן להחליף את הליזה ההיפוטונית השנייה על ידי השעיה עדינה מחדש של שכבת RBC השיורית והסרת כל הסופרנטנט, מכיוון שהמשקעים הנותרים של RBC ישקעו מעל גלולת PMN.
8. השליכו את הסופרנאטנט על ידי מזיגת הצינור, השהו מחדש בעדינות את ה-PMN במאגר הנותר, והעבירו אותם למיקרו-צינור קר כקרח.
   הערה: הקפד להוסיף ביאורים לעוצמת הקול בעת העברת התאים המרחפים מחדש באמצעות מיקרופיפטה.
9. מעבירים 3 x 1 μL של תרחיף התא למגלשת זכוכית נקייה (שלוש בארות של 1 μL כל אחת) וכתם עם פנאופטיקה מהירה (ראה טבלת חומרים) להערכת מורפולוגיה וטוהר¹².
   1. כדי להכתים בפנאופטי מהיר, יש לטבול את המגלשה חמש פעמים ב-panoptic fixative n° 1, שש פעמים ב-eosin n° 2 ופעמיים ב-hematoxylin n° 3, כאשר כל טבילה נמשכת שנייה אחת.
   2. שטפו בעדינות את מגלשת הזכוכית במים מזוקקים.
   3. יש לנקז ולייבש באוויר.
10. התבוננו תחת מיקרוסקופ וספרו 300 תאים אקראיים בכל באר, ובכך הבדילו את הנויטרופילים מגרנולוציטים אחרים.
11. מעבירים 1 μL של תרחיף התא ל-49 μL של 0.2% צבע כחול טריפאן¹³ וסופרים את התאים באמצעות תא נויבאואר, תוך הבחנה בין תאים מתים לתאים בני קיימא.
12. התאימו את ריכוז התאים ל-6,667 תאים/מיקרוליטר באמצעות תמיסה של 50% פלזמה אוטולוגית ו-50% HBSS בתוספת סידן ומגנזיום. חלק את התרחיף של 6,667 תאים/μL באופן שווה בין המיקרו-צינורות המתאימים לתנאים שיש לבדוק, כולל הבקרה השלילית.
    הערה: ניתן להשתמש בכל ריכוז תאים הדומה לנויטרופילים המסתובבים באורגניזם המודל, אך חשוב להשתמש באותו ריכוז תאים בכל הניסויים לצורך שחזור.

איור 1: פרוטוקול בידוד הנויטרופילים. שני ריכוזים של מצע ההפרדה (פרקול) (A) מוערמים (B), ואז הדם מונח בשכבות על גבי שיפוע ההפרדה (C). לאחר הצנטריפוגה, PMN נמצא בשכבה המרכזית (D), המחולקת לשני צינורות 15 מ"ל (E). תרחיף התא נשטף פעמיים ב- HBSS ובצנטריפוגה (G-I) כדי להסיר את המדיה, ואז התאים מושהים מחדש, ושאריות RBCs נשלחות לשני סבבים של ליזה היפוטונית (J-M). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנה להפעלת נויטרופילים

1. במיקרו-צינוריות של 1.5 מ"ל, הכינו מערכת הפעלה לכל מצב כך שריכוז התא הסופי יהיה 6,600 תאים/μL. לדוגמה, כדי לבדוק את ההשפעות של 100 nM fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine; ראה טבלה של חומרים), להוסיף 5 μL של 10 μM fMLP ל 495 μL של 6,667 תאים / μL תרחיף. עבור הבקרה השלילית (ללא גירוי), הוסף HBSS המכיל Ca²⁺ ו- Mg²⁺.
   הערה: כדי להדגים מתודולוגיה זו, נעשה שימוש בריכוזים הסופיים הבאים של הגירויים: 100 nM fMLP, 16 μM של fallaxin, פפטיד אנטי-מיקרוביאלי טבעי¹⁴, ו-100 nM PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) (ראה טבלת חומרים).
2. לדגור ב 37 ° C ללא סיבוב.
   הערה: כל ה- aliquots עבור בדיקות פונקציונליות נלקחים מהשעיית תא זו, המכונה להלן מערכת ההפעלה.

4. בדיקת Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) להערכת ייצור ROS

1. הכנת פתרון עבודה NBT: עבור כל תנאי ניסוי, הכינו פתרון עבודה NBT (ראה טבלת חומרים) של 6 מילימטר באמצעות השלבים הבאים:
   1. יש להמיס 0.0005 גרם של NBT ב-10 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ומערבולת למשך 15 דקות לפחות.
   2. מוסיפים 90 μL של HBSS Ca²⁺Mg²⁺ ומערבלים עד 2 דקות.
      הערה: יש לבצע את כל השלבים הקשורים ל-NBT בחושך.
2. בצע בדיקת שקופיות NBT.
   1. לאחר 20 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את מתלה התא והעבירו בזהירות 2 μL של PMN למגלשת זכוכית נקייה. יש לדגור במשך 20 דקות בתא לח בטמפרטורה של 37°C.
      הערה: אין לפזר את מתלה התא יותר מדי על המגלשה; אחרת הוא עלול להתייבש לפני הדגירה.
   2. הוסף 1 μL של תמיסת העבודה NBT מעל התאים ודגרה נוספת במשך 20 דקות מוגן מפני אור.
   3. יבש את המגלשה עם אוויר חם לתקן אותו עם טיפה מתנול בכל באר במשך 1 דקה. מכתים עם 0.03% ספרנין (ראו טבלת חומרים) למשך דקה.
   4. שטפו בעדינות את מגלשת הזכוכית במים מזוקקים.
   5. הניחו למגלשה להתייבש באוויר והתבוננו תחת מיקרוסקופ.
   6. ספרו 100 תאים אקראיים בכל באר, והבינו נויטרופילים עם וללא משקעי פורמזן.
3. בצע בדיקת ספקטרופוטומטריה של NBT.
   1. לאחר 40 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את תרחיף התא והעבירו 90 מיקרוליטר של PMN ממערכת ההפעלה למיקרו-צינורית נקייה. לאחר מכן, הוסף בזהירות 20 μL של תמיסת NBT 6 mM. לדגור בחושך במשך 20 דקות ב 37 ° C.
   2. הוסף 100 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS; ראה טבלה של חומרים) ומערבולת.
   3. סוניק באמצעות קצה סוניקטור באמפליטודה של 60%, חמישה מחזורים של 15 שניות כל אחד עם מרווחים של 15 שניות. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 5 דקות.
   4. מעבירים 60 מיקרוליטר של הסופרנאטנט לצלחת בעלת תחתית שקופה של 96 בארות ומודדים את ספיגת תוצר הפורמזן ב-570 ננומטר.

5. בדיקת פגוציטוזה

1. הכינו תרחיף של 33,000 שמרים/מיקרוליטר לכל מצב, כמתואר להלן:
   1. הוסיפו כ-0.75 מ"ג שמרים יבשים (Saccharomyces cerevisiae; ראו טבלת חומרים) ל-200 מיקרוליטר של HBSS Ca²⁺Mg²⁺ ודגרו בתרמומיקסר בטמפרטורה של 100°C עם 500 סל"ד למשך 15 דקות לפחות.
   2. הומוגניזציה של התערובת על ידי ערבול והעברת 5 μL של תרחיף שמרים ל 45 μL של 0.2% צבע כחול טריפאן. ספרו את השמרים באמצעות תא נויבאואר.
   3. התאימו את ריכוז התרחיף הראשוני ל-33,000 תאי שמרים/μL באמצעות HBSS Ca²⁺Mg²⁺. יש לשמור את המתלים על קרח עד לשימוש.
2. לאחר 20 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את תרחיף התא והעבירו 5 μL של מערכת ההפעלה ל-5 μL מתוך 33,000 השמרים/μL Saccharomyces cerevisiae suspension במיקרו-צינורית סטרילית חדשה.
   הערה: יחס הנויטרופילים לשמרים הוא 1:5 (PMN:שמרים).
3. העבירו מיד 6 μL של תרחיף PMN/שמרים לשלוש בארות של מגלשת זכוכית נקייה (2 μL כל אחת) ודגרו על המגלשה בתא לח למשך 40 דקות.
   הערה: אין לפזר את מתלה התא יותר מדי על המגלשה; אחרת, הוא עלול להתייבש לפני הדגירה.
4. יבש את המגלשה תחת אוויר חם והכתים עם פנאופטיקה מהירה, כמתואר בשלב 2.9 לעיל.
   הערה: השלב השלישי של הצביעה הפנופטית המהירה הוא קריטי לניתוח המיקרוסקופ של השקופית. צביעת השקופית במשך ≥3 שניות בשלב זה עלולה להפוך אותה ללא ראויה לניתוח, מכיוון שיהיה קשה להבדיל בין שמרים לאונות גרעיניות של נויטרופילים.
5. התבוננו בשקופיות מתחת למיקרוסקופ, ספרו 100 נויטרופילים אקראיים מכל באר והבחינו בין PMN חיובי ושלילי לפאגוציטוזה.
   הערה: לפחות חלקיק שמרים אחד בתוך או במגע ישיר עם קרום תא PMN מצביע על PMN חיובי לפאגוציטוזה. אם אתם מעוניינים ביחס שמרים/נויטרופילים, ספרו גם את מספר חלקיקי השמרים שנבלעו.

6. בדיקת כימוטקסיס PMN בזמן אמת

הערה: בדיקת ההעברה מבוצעת באופן דומה לפרוטוקול המתואר previoulsy¹⁵, עם ההתאמות הבאות:

1. הכינו את השיפוע הכימוטקטי על ידי הוספת 160 מיקרוליטר של כימואטרקנט (למשל, fMLP, IL-8, C5 או LTB4; ראו טבלת חומרים) לתא התחתון של צלחת מנתח תאים בזמן אמת (RTCA) מבוסס עכבה. עבור בקרות שליליות וחסרים, הוסף 160 μL של HBSS Ca²⁺Mg²⁺.
2. חבר את החדר העליון והוסף 25 μL של HBSS Ca²⁺Mg²⁺. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות כדי ליצור את השיפוע הכימוטקטי.
3. לאחר 60 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את מתלה התא והניחו 60 מיקרוליטר של תרחיף התא בתא העליון. הוסף 60 μL של HBSS Ca²⁺Mg²⁺ לריק.
4. הניחו את צלחת RTCA ותכנתו את תוכנת RTCA למדוד את אינדקס התא (CI) כל 60 שניות למשך שעתיים.
   הערה: ניתן לשטוף את לוחות RTCA לשימוש חוזר כמתואר¹⁶. לסיכום, שטפו את תאי RTCA והאלקטרודות עם מי מלח פוספט-בופר (PBS) שלוש פעמים, ולאחר מכן עם מים אולטרה-טהורים מסוג I פעמיים. יש לדגור על החדר התחתון והעליון עם 0.25% טריפסין 0.53 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) למשך 40 דקות. יש לשטוף במים טהורים במיוחד שלוש פעמים.

7. בדיקה סוגסטיבית נטו

1. לאחר 10 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את תרחיף התא והעבירו 4 μL של PMN מכל מערכת הפעלה תחת הערכה, המחולקים לשתי בארות של מגלשת זכוכית נקייה. יש לדגור בתא לח בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
2. הוסף 1 μL של DNAse I לאחת הבארות ודגר במשך 20 דקות ב 37 ° C (בתא רטוב).
3. יבש את המגלשה ואת הכתם עם panoptic מהיר, כפי שתואר קודם בשלב 2.9 של סעיף "בידוד נויטרופילים".
4. הערך את השקופיות תחת מיקרוסקופ.
   הערה: חפש כל אינדיקציה לשחרור נטו, המאופיינת בנוכחות של מבנים דמויי אינטרנט. לאחר הזיהוי, ודא אם הטיפול ב- DNAse I היה מסוגל להסיר מבנים כאלה. בדיקה זו מרמזת על היווצרות NET, שכן נדרשות בדיקות נוספות כדי לאשר את נוכחותם.

תוצאות

שיטת הבידוד מבוססת הצפיפות ששימשה במחקר זה (איור 1) עמדה בקריטריונים של הניסויים המוצעים. פרמטרים נויטרופילים שהתקבלו משיטה זו כללו כדאיות ≥98%, טוהר ≥94%, ותפוקת תאים ≥1.5 x 10⁷, ללא הפעלה שניתן לזהות על ידי בדיקות הסינון. שני שלבים רלוונטיים בבידוד PMN הם נוגדי קרישה והסרת ...

Discussion

נויטרופילים הם תאים דינמיים ומגיבים מאוד, קצרי חיים שעדיין לא ניתן לשמר אותם^{בהקפאה 19}, מה שהופך את חקירת הביולוגיה שלהם למאתגרת. לכן, חיוני לעקוב אחר צעדים זהירים כדי להשיג נויטרופילים קיימא, מועשר ומנוחה^11,20. במחקר זה נעשה שימוש בטכניקת בידוד מב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software