التحضير خارج الجسم الحي لشريحة الحبل الشوكي لتسجيل المشبك التصحيحي للخلية الكاملة في الخلايا العصبية الحركية أثناء تحفيز الحبل الشوكي

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في وقت واحد.

Abstract

يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). نظرا لأن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة الأخيرة لتنفيذ السلوكيات الحسية الحركية ، فإن الدراسة المباشرة للاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS يمكن أن تساعدنا في فهم المنطق الأساسي لتعديل الحركة الشوكية. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة لدراسة الخصائص الفيزيولوجية الكهربية على نطاق خلية واحدة. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الصعوبات المعقدة في تحقيق هذا الهدف ، بما في ذلك الحفاظ على صلاحية الخلية ، وفصل الحبل الشوكي بسرعة عن البنية العظمية ، واستخدام SCS لتحفيز جهود الفعل بنجاح. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام patch-clamp لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجربة والخطأ غير الضروريين.

Introduction

يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). أفاد Andreas Rowald et al. أن SCS تمكن الطرف السفلي من وظيفة المحرك والجذع في غضون يوم واحد¹. يعد استكشاف الآلية البيولوجية ل SCS للتعافي الحركي مجالا بحثيا مهما وشائعا لتطوير استراتيجية SCS أكثر دقة. على سبيل المثال ، أظهر فريق Grégoire Courtine أن الخلايا العصبية البينية Vsx2 المثيرة والخلايا العصبية Hoxa10 في الحبل الشوكي هي الخلايا العصبية الرئيسية للاستجابة ل SCS ، والتعديل العصبي الخاص بالخلية ممكن لاستعادة قدرة الفئران على المشي بعد SCI². ومع ذلك ، تركز دراسات قليلة على الآلية الكهربائية ل SCS على نطاق خلية واحدة. على ال....

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام على جميع التجارب على وأجريت الدراسات وفقا للوائح رعاية ذات الصلة.

1. إعداد

1. 1. معلومات السكن: إيواء ذكور فئران Sprague-Dawley (بعد الولادة 10-14 يوما ، P10-P14) في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض.
      ملاحظة: تم الحفاظ على ظروف الغرفة عند 20 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، الرطوبة: 50٪ -60٪ ، مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. كان للحيوانات حرية الوصول إلى الطعام والماء.
   2. قم بتسمية الخلايا العصبية الحركية بأثر رجعي: حقن Fluoro-Gold (FG) في عضلة الظنبوب الأمامية الثنائية وعضلة الساق (2٪ في محلول ملحي معقم ، 50 ميكرولتر لكل عضلة) لتسمية الخلايا العصبية الحركية بأثر رج....

النتائج

بفضل الصيانة الصارمة لدرجات الحرارة المنخفضة أثناء التشغيل الجيد (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 والشكل 1) ، كانت صلاحية الخلية جيدة بما يكفي لإجراء التسجيلات الكهربية اللاحقة. لمحاكاة السيناريو السريري قدر الإمكان ، استخدمنا المعالجة الدقيقة لوضع كاثود SCS وا.......

Discussion

تتقارب معلومات الحركة المعدلة بواسطة SCS أخيرا مع الخلايا العصبية الحركية. لذلك ، فإن أخذ الخلايا العصبية الحركية كهدف للبحث قد يبسط تصميم الدراسة ويكشف عن آلية التعديل العصبي ل SCS بشكل مباشر أكثر. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2