Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في وقت واحد.

Abstract

يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). نظرا لأن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة الأخيرة لتنفيذ السلوكيات الحسية الحركية ، فإن الدراسة المباشرة للاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS يمكن أن تساعدنا في فهم المنطق الأساسي لتعديل الحركة الشوكية. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة لدراسة الخصائص الفيزيولوجية الكهربية على نطاق خلية واحدة. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الصعوبات المعقدة في تحقيق هذا الهدف ، بما في ذلك الحفاظ على صلاحية الخلية ، وفصل الحبل الشوكي بسرعة عن البنية العظمية ، واستخدام SCS لتحفيز جهود الفعل بنجاح. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام patch-clamp لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجربة والخطأ غير الضروريين.

Introduction

يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). أفاد Andreas Rowald et al. أن SCS تمكن الطرف السفلي من وظيفة المحرك والجذع في غضون يوم واحد1. يعد استكشاف الآلية البيولوجية ل SCS للتعافي الحركي مجالا بحثيا مهما وشائعا لتطوير استراتيجية SCS أكثر دقة. على سبيل المثال ، أظهر فريق Grégoire Courtine أن الخلايا العصبية البينية Vsx2 المثيرة والخلايا العصبية Hoxa10 في الحبل الشوكي هي الخلايا العصبية الرئيسية للاستجابة ل SCS ، والتعديل العصبي الخاص بالخلية ممكن لاستعادة قدرة الفئران على المشي بعد SCI2. ومع ذلك ، تركز دراسات قليلة على الآلية الكهربائية ل SCS على نطاق خلية واحدة. على الرغم من أنه من المعروف أن محفز التيار المباشر فوق العتبة يمكن أن يثير جهود الفعل (APs) في تجربة الحبار الكلاسيكية3،4،5 ، إلا أن كيفية تأثير التحفيز الكهربائي المتناوب النبضي ، مثل SCS ، على توليد إشارة المحرك لا يزال غير واضح.

نظرا لتعقيد الدوائر العصبية داخل العمود الفقري ، فإن الاختيار المناسب لسكان الخلايا مهم للتحقيق في الآلية الكهربائية ل SCS. على الرغم من أن SCS يستعيد الوظيفة الحركية عن طريق تنشيط مسار الحس العميق6 ، فإن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة النهائية لتنفيذ الأمر الحركي ، المستمدة من دمج معلومات استقبال الحس العميق7. لذلك ، يمكن أن تساعدنا الدراسة المباشرة للخصائص الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS في فهم المنطق الأساسي لتعديل المحرك الشوكي.

كما نعلم ، فإن مشبك التصحيح هو الطريقة القياسية الذهبية للتسجيل الكهربي الخلوي بدقة زمانية مكانية عالية للغاية8. لذلك ، تصف هذه الدراسة طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS. بالمقارنة مع مشبك رقعة الدماغ9 ، فإن مشبك رقعة الحبل الشوكي أكثر صعوبة للأسباب التالية: (1) الحبل الشوكي محمي بواسطة القناة الفقرية ذات الحجم الصغير ، الأمر الذي يتطلب معالجة دقيقة للغاية وصيانة صارمة للجليد للحصول على صلاحية أفضل للخلايا. (2) نظرا لأن الحبل الشوكي نحيف جدا بحيث لا يمكن تثبيته على صينية القطع ، فيجب غمره في أغاروز منخفض نقطة الانصهار وتقليمه بعد التصلب.

ومن ثم ، توفر هذه الطريقة تفاصيل فنية في تشريح الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت وذلك لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجارب والأخطاء غير الضرورية.

Protocol

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام على جميع التجارب على وأجريت الدراسات وفقا للوائح رعاية ذات الصلة.

1. إعداد

    1. معلومات السكن: إيواء ذكور فئران Sprague-Dawley (بعد الولادة 10-14 يوما ، P10-P14) في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض.
      ملاحظة: تم الحفاظ على ظروف الغرفة عند 20 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، الرطوبة: 50٪ -60٪ ، مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. كان للحيوانات حرية الوصول إلى الطعام والماء.
    2. قم بتسمية الخلايا العصبية الحركية بأثر رجعي: حقن Fluoro-Gold (FG) في عضلة الظنبوب الأمامية الثنائية وعضلة الساق (2٪ في محلول ملحي معقم ، 50 ميكرولتر لكل عضلة) لتسمية الخلايا العصبية الحركية بأثر رجعي قبل يومين من التضحية.
  2. محاليل
    1. تحضير محلول القطع: مزيج 120 مليمول كلوريد الكولين, 2.6 ملليمتر كيل, 26 مليمتر NaHCO 3, 1.25 ملليمتر NaH 2 PO4, 0.5 ملليمتر كلوريد الكلور 2, 7 ملليمتر MgCl 2, 1.3 ملليمتر حمض الأسكوربيك, 15 ملليمتر الجلوكوز. قبل الفقاعة المحلول مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2 (اضبط على درجة الحموضة 7.4 مع KOH) لمدة 30 دقيقة قبل التشريح والتقطيع. تبريد الحل مع الثلج المجروش.
    2. تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF): مزيج 126 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 3 مللي متر KCl ، 1.2 مللي متر NaH2PO4 ؛ 1.3 مللي مول MgCl 2 ، 2.4 mM CaCl2 ، 26 mM NaHCO3 ، و 10 mM الجلوكوز. قبل فقاعة الحل مع 95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO2 لمدة 30 دقيقة قبل الحضانة.
    3. تحضير محلول داخل الخلايا: مزيج 126 مللي مول K-غلوكونات ، 2 مللي مول KCl ، 2 مللي مول MgCl 2 ، 0.2 مللي متر EGTA ، 10 mM HEPES ، 4 mMNa2 ATP ، 0.4 mM Na2 GTP ، 10 mM K-Phosphocreatine ، و 0.5٪ Neurobiotin (درجة الحموضة 7.25 و 305 mOsm / Kg). تبريد الحل مع الثلج المجروش.
    4. تحضير هلام الأغاروز منخفض الذوبان: قم بإذابة 4 جم من الأغاروز في 100 مل من محلول القطع ، واستخدم دوار تحريك مغناطيسي لإذابته بالكامل. في 30 دقيقة قبل التضمين ، سخني الأغاروز منخفض النقطة في فرن الميكروويف بقوة عالية لمدة 1 دقيقة ، ثم انقله إلى حمام مائي 39 درجة مئوية للحفاظ على الحالة السائلة.
  3. إعداد الصك
    1. ضع الثلج المجروش على صينية التروية (الشكل التكميلي 1 أ) قبل 10 دقائق من التروية. ضع الصينية التشريحية (الشكل التكميلي 1 ب) وصينية القطع (الشكل التكميلي 1 ج) مع شريط ماء عند -80 درجة مئوية طوال الليل مقدما.
    2. ضع حجرة الحضانة بشبكة من النايلون في الفرن على حرارة 45 درجة مئوية طوال الليل مقدما.
    3. استخدم أغاروز نقطة انصهار منخفضة لتصنيع منحدر 35 درجة ومنصة بسمك 2 مم (الشكل التكميلي 1D). بعد تصلب الجل ، ضعه في وسط طبق بتري 35 مم لدعم الحبل الشوكي في الإجراءات القادمة.
  4. التروية داخل القلب
    1. تخدير الفئران ب 2.5٪ ثلاثي برومو إيثانول (160 ميكرولتر / 10 جم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكد من تخدير الفئران بالكامل عن طريق التحقق من عدم الاستجابة للمحفزات الخارجية ، مثل قرصة لطيفة من إصبع القدم.
    2. عندما يتم تأكيد التخدير المناسب ، ضع الفئران مستلق وشل حركتها في طبق بتري المملوء بهلام السيليكا.
    3. قطع شق جلدي طولي 5 مم ذيليا لعملية الخنجري ، ثم قم بتوسيع المساحة تحت الجلد بالكامل. قم بقطع شق جلدي طولي بطول 2 سم على طول خط الوسط البطني لكشف جدار الصدر الخارجي بالكامل ، بدءا من الشق المذكور أعلاه وينتهي بالجزء العلوي من الصدر.
    4. استخدم ملاقط مسننة لرفع الخنجري (الشكل التكميلي 2 أ) ، ثم استخدم مقصا ناعما لقطع الحجاب الحاجز. قطع القص على طول جانبي عملية الخنجري لفتح الصدر وكشف القلب (الشكل التكميلي 2 ب).
      ملاحظة: كن حذرا للحفاظ على الأوعية الصدرية الداخلية على كلا الجانبين. خلاف ذلك ، قد يسبب نزيف حاد.
    5. استخدم ملاقط بلا أسنان لرفع البطين الأيسر. أدخل إبرة 22 G في قمة البطين الأيسر على طول المحور الطولي للبطين الأيسر (الشكل التكميلي 2C). في هذه الأثناء ، راقب نبض الدم الإيقاعي في أنبوب التروية ، أو قد تثقب الإبرة في البطين الأيمن ، مما قد يؤدي إلى تأثير نضح ضعيف.
      ملاحظة: لا ينبغي أن تستخدم ملقط مسنن. وإلا فقد يتسبب ذلك في تسرب دم إضافي من موقع الملقط.
    6. استخدم مقصا ناعما لقطع الأذين الأيمن (الشكل التكميلي 2C) ، ثم قم بحقن 100 مل يدويا من سائل الترشيح المثلج بمعدل حوالي 2 مل / ثانية في غضون دقيقة واحدة.
      ملاحظة: عندما يتحول كبد الفئران ومخالبها إلى لون باهت ، ولا يتدفق الدم من الأذين الأيمن ، يمكن تحقيق نضح جيد.
  5. تشريح الحبل الشوكي (الشكل 1)
    1. ضع الجرذ في وضعية الانبطاح ، واقطع العمود الفقري عند العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي (حوالي مستوى العمود الفقري L4) ونقطة تحول الانحناء للعمود الصدري (حوالي مستوى العمود الفقري T6) ، على التوالي (الشكل 1 أ). ثم ، ضع العمود الفقري المعزول على الفور في محلول الرش المثلج البارد المؤكسج لغسل الدم المتبقي والأنسجة الدهنية ؛ هذا الإجراء مفيد للحفاظ على نظافة مجال المنطوق في الإجراءات اللاحقة.
      ملاحظة: يجب حجز العضلات المجاورة للعمود الفقري ، مما يساعد على التثبيت اللاحق للعمود الفقري باستخدام دبوس الحشرات.
    2. انقل العمود الفقري المعزول على الفور إلى الدرج التشريحي (الشكل 1 ب) مع الجانب الظهري لأعلى ونهاية المنضدة بالقرب من المشغل. املأ الدرج التشريحي ب 50 مل من محلول القطع بالثلج البارد المؤكسج باستمرار (الشكل 1 ب).
    3. استخدم أربعة دبابيس حشرة لإصلاح العمود الفقري عن طريق اختراق عضلات العمود الفقري (الشكل 1 ب).
    4. تحت مجهر التشريح ، قم بقطع عنيق العمود الفقري لكلا الجانبين من نهاية المنضدة بالمقص الدقيق ، والذي يمكن تسميته "استئصال الصفيحة الفقرية" (الشكل 1C). انتبه لعدم إتلاف الحبل الشوكي. وفي الوقت نفسه ، استخدم الملقط ذو الأسنان الدقيقة لرفع الجسم الفقري المقطوع.
    5. بعد استئصال الصفيحة الفقرية ، لا تفصل الحبل الشوكي عن القناة الشوكية على الفور. بدلا من ذلك ، استخدم مقصا صغيرا لقطع الأم الجافية على طول خط الوسط الظهري ، مما يساعد على امتصاص العناصر الغذائية بين الخلايا و ACSF المؤكسج (الشكل 1 د).
      ملاحظة: لا تمزق الأم الجافية أبدا. يسمح فقط بقطع الأم الجافية بواسطة مقص دقيق ؛ خلاف ذلك ، سوف يتضرر جذر العصب وحمة العمود الفقري بشكل خطير!
    6. ارفع الجزء المنقاري من الحبل الشوكي ، ثم اقطع جذر العصب بعناية مع تخصيص حوالي 1 مم (الشكل 1E). بعد فصل الحبل الشوكي عن القناة الفقرية ، استخدم دبابيس حشرة لإصلاح الحبل الشوكي مع الجانب البطني لأعلى (الشكل 1F).
    7. استخدم مقصا صغيرا لقطع الأم الجافية على طول خط الوسط البطني (الشكل 1F). قطع جذور الأعصاب الزائدة عن الحاجة مع حوالي 1 مم محفوظة.
      ملاحظة: العصب أكثر عنادا من الحبل الشوكي. إذا كان جذر العصب المحجوز طويلا جدا (>1 مم) ، فلن يتمكن الاهتزاز من قطع جذر العصب ، مما قد يؤدي إلى تمزق خطير في حمة العمود الفقري.
    8. استخدم مقصا صغيرا لفصل التوسيع القطني بطول 6-7 مم (الشكل 1 ج).
  6. التضمين في الأغاروز منخفض الذوبان
    1. ضع التوسيع القطني على منحدر 35 درجة (الشكل 1H) مع الجانب الظهري لأعلى والنهاية الذيلية لأسفل. استخدم ورق ترشيح ماص لإزالة الماء الوفير على سطح الأنسجة (الشكل 1H).
    2. صب ببطء هلام الأغاروز المنصهر في طبق بتري الذي يحتوي على تضخم أسفل الظهر (الشكل 1I).
      ملاحظة: لا تصب بسرعة كبيرة ، وإلا ستتراكم الفقاعات في الجل.
    3. ضع طبق بتري أعلاه في خليط الماء المثلج لتبريد الجل في أسرع وقت ممكن ، مما يساعد على الحفاظ على نشاط الخلايا.
    4. قم بقص الجل إلى مكعب 15 مم × 10 مم × 10 مم وقم بتثبيته على قرص العينة باستخدام الغراء الفائق (الشكل 1J).
  7. تشريح
    1. ضع قرص العينة في صينية القطع المجمدة مسبقا ، ثم صب محلول القطع المثلج (الشكل 1K). فقاعة باستمرار مع 95٪ CO 2 و 5٪ O2 في صينية القطع.
    2. اضبط معلمات الاهتزاز: السماكة: 350 ميكرومتر ؛ السرعة: 0.14-0.16 مم / ثانية ، السعة: 1.0 مم ، وتردد الاهتزاز: 85 هرتز.
    3. حصاد 2-3 شرائح مناسبة لكل. سجل 1-2 خلية عصبية حركية FG + صحية لكل شريحة ، مع مجموعة من 5-6 خلايا لكل.
  8. حضانة المرض
    1. استخدم ملاقط انزلاق الغطاء لقص شريحة (الشكل 1 ل) ووضعها في غرفة الحضانة المملوءة ب ACSF المؤكسج باستمرار. ضع غرفة الحضانة في حمام مائي على حرارة 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم استمر في احتضانها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة أخرى قبل التسجيل.
      ملاحظة: يجب إكمال الإجراءات المذكورة أعلاه ، من التخدير إلى الحصول على الشريحة الأولى ، في غضون 20-30 دقيقة للاحتفاظ بصلاحية الخلايا قدر الإمكان. يمكن للخلايا العصبية الحركية في كل شريحة الحفاظ على صلاحيتها لمدة 6-7 ساعات تقريبا.

2. تسجيل المشبك التصحيح مع SCS (الشكل 2)

  1. التحضيرات
    1. قم بتهوية غرفة التسجيل بفقاعات ACSF باستمرار بمعدل حوالي 1-2 مل / دقيقة. اضبط معدل التدفق بشكل فردي عبر لوحة التحكم في المضخة التمعجية.
    2. ضع شريحة في حجرة التسجيل. استخدم سلك البلاتين على شكل حرف U مع خيوط النايلون لتثبيت الشريحة بإحكام في مكانها.
    3. استخدم مجهر تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) لمراقبة الشريحة. تحت العدسة الموضوعية 4x ، تأكد من أن طول الجذر الظهري حوالي 1 مم. ابحث عن المنطقة التي يدخل فيها الجذر الظهري إلى الحمة ، ثم انقل مجال الرؤية المركزي إلى هذه المنطقة.
    4. قم بتوصيل مولد النبض بأقطاب كهربائية مخصصة (الشكل 2 أ).
  2. تكوين SCS
    1. ضع أنود SCS بالقرب من خط الوسط الظهري عبر نظام المعالجة الدقيقة (الشكل 2 ب).
    2. ضع كاثود SCS بالقرب من منطقة دخول الجذر الظهري (DREZ) عبر نظام المعالجة الدقيقة (الشكل 2B).
  3. استهداف الخلايا وتصويرها
    1. استخدم IR-DIC مع عدسة موضوعية 10x تقريبا ابحث عن المنطقة الظهرية الجانبية للعمود الحركي ، حيث توجد معظم الخلايا العصبية الحركية. ثم انقل مجال الرؤية المركزي إلى هذه المنطقة.
    2. قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية 60x للعثور على خلية عصبية صحية ذات سطح أملس ومشرق ونوى غير مرئية (الشكل 2C ، F).
    3. قم بخفض شدة الأشعة تحت الحمراء قليلا وقم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري. قم بتبديل مرشح الضوء إلى مرشح الإثارة فوق البنفسجية واسع النطاق (الشكل 2D ، G) ، لتحديد خلية عصبية حركية مناسبة موجبة ل FG (FG +) (الشكل 2E ، H).
    4. استخدم أقطاب الشفط لتطبيق تحفيز عتبة المحرك 1x على الجذر الظهري. إذا تم الكشف عن جهد فعل مستثار في الخلايا العصبية الحركية (الشكل التكميلي 3) ، فإنه يؤكد أن نشاط الجذر الظهري سليم. إذا لم يكن كذلك ، يجب التخلص من هذه الشريحة.
  4. تسجيل المشبك التصحيح
    1. املأ الماصة الدقيقة بالمحلول داخل الخلايا وأدخله في حامل القطب. استخدم نظام المعالجة الدقيقة لخفض الماصة في حمام ACSF. تتراوح مقاومة الماصة من 5-8 MΩ.
    2. ضع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي على الماصة لإزالة الغبار وحطام الخلايا.
      1. اخفض القطب للاقتراب من الخلية. عندما تلامس الماصة سطح الخلايا العصبية FG + ، تصبح المسافة البادئة الصغيرة للغشاء مرئية على مستوى الطرف. حرر الضغط الإيجابي.
      2. ثم ، ضع كمية صغيرة من الضغط السلبي على الماصة باستخدام حقنة. هذا يخلق كمية صغيرة من الشفط الذي يسحب غشاء الخلية إلى اتصال مع ماصة الزجاج. انتبه دائما إلى المقاومة الكلية على واجهة البرنامج حتى تزداد قيمة المقاومة إلى جيجاأوم (>1 GΩ). ثم ، يتم تشكيل gigaseal.
    3. قم بتثبيت جهد الغشاء عند -70 مللي فولت ، ثم اضغط على زر تعويض السعة السريع على واجهة برنامج مكبر الصوت. قم بتطبيق ضغط سلبي عابر برفق لتمزق غشاء الخلية ، ثم اضغط على زر تعويض السعة البطيئة على واجهة برنامج مكبر الصوت. في هذه المرحلة ، يتم الحصول على تكوين جيد للخلية الكاملة.
    4. قم بالتبديل إلى وضع المشبك الحالي بالنقر فوق الزر IC على واجهة البرنامج ، وسجل إمكانات غشاء الراحة (RMP).
    5. قم بتطبيق SCS لمدة 1-2 ثانية بسعة 1-10 مللي أمبير ، بينما يتم تثبيت عرض النبضة وترددها عند 210 ميكروثانية و 40 هرتز على التوالي. حدد عتبة المحرك عن طريق زيادة سعة التحفيز ببطء حتى يتم ملاحظة نقطة الوصول الأولى.
    6. التمييز بين الخلايا العصبية الحركية المتأخرة والفورية باستخدام حقن تيار إزالة الاستقطاب لمدة 5 ثوان حول قاعدة ريوبيس في وضع المشبك الحالي10،11،12. الخلايا العصبية الحركية ذات الإطلاق الفوري: يمكن أن تؤدي القاعدة المنخفضة إلى إطلاق فوري ومتكرر بتردد إطلاق مستقر ؛ تأخر إطلاق الخلايا العصبية الحركية: يمكن أن تؤدي قاعدة الريو العالية إلى تأخر ظهور إطلاق النار المتكرر بمعدل إطلاق متسارع (الشكل 3).
    7. عند إيقاف تشغيل SCS ، استمر في تسجيل إمكانات الغشاء لالتقاط إطلاق APs التلقائي.
    8. قم بإجراء تسجيلات مشبك الجهد لتسجيلات مشبك الجهد للتيار المشبكي المثير (EPSC) عند تشغيل SCS وإيقاف تشغيله. معلمة التحفيز هي عتبة محرك 1x ، 210 μs ، 2 هرتز.

النتائج

بفضل الصيانة الصارمة لدرجات الحرارة المنخفضة أثناء التشغيل الجيد (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 والشكل 1) ، كانت صلاحية الخلية جيدة بما يكفي لإجراء التسجيلات الكهربية اللاحقة. لمحاكاة السيناريو السريري قدر الإمكان ، استخدمنا المعالجة الدقيقة لوضع كاثود SCS وا...

Discussion

تتقارب معلومات الحركة المعدلة بواسطة SCS أخيرا مع الخلايا العصبية الحركية. لذلك ، فإن أخذ الخلايا العصبية الحركية كهدف للبحث قد يبسط تصميم الدراسة ويكشف عن آلية التعديل العصبي ل SCS بشكل مباشر أكثر. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة ?...

Disclosures

اي

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين للعلماء الشباب (52207254 و 82301657) وصندوق علوم ما بعد الدكتوراه الصيني (2022M711833).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Ascorbic AcidSigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
Cover slide tweezersVETUS36A-SAClip a slice
D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Fine scissorsRWD Life ScienceS12006-10Cut the diaphragm
Fluorescence Light SourceOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeLabel the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
infrared CCD cameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconateSigmaP1847
Low melting point agaroseSigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
Micromanipulator Sutter Instrument MP-200
Micropipette pullerSutter instrumentP1000
Micro-scissors Jinzhongwa1020Laminectomy
Microscope for anatomyOlympus SZX10
Microscope for ecletrophysiologyOlympus BX51WI
Micro-toothed tweezersRWD Life ScienceF11008-09Lift the cut vertebral body
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphocreatineSigmaP7936
Objective lens for ecletrophysiologyOlympus LUMPLFLN60XWworking distance 2 mm 
Osmometer Advanced FISKE 210
Patch-clamp amplifier Axon Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizerAxon Digidata 1550B
pH meter Mettler Toledo FE28
Slice AnchorMultichannel systemSHD-27H
Spinal cord stimulatiorPINST901
Toothed tweezerRWD Life ScienceF13030-10Lift the xiphoid
VibratomeLeicaVT1200S
Wide band ultraviolet excitation filterOlympus U-MF2

References

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved