Подготовка ex vivo среза спинного мозга для регистрации цельноклеточного патча-зажима в двигательных нейронах при стимуляции спинного мозга

Резюме

Этот протокол описывает метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на стимуляцию спинного мозга (SCS) с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователям улучшить свои навыки в разделении спинного мозга и поддержании жизнеспособности клеток одновременно.

Аннотация

Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Поскольку двигательные нейроны являются конечной единицей для выполнения сенсомоторного поведения, непосредственное изучение электрических реакций двигательных нейронов с помощью SCS может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинномозговой моторной модуляции. Для одновременной регистрации различных характеристик стимулов и клеточных реакций патч-зажим является хорошим методом изучения электрофизиологических характеристик в масштабе одной клетки. Тем не менее, все еще существуют некоторые сложные трудности в достижении этой цели, включая поддержание жизнеспособности клеток, быстрое отделение спинного мозга от костной структуры и использование SCS для успешного индуцирования потенциалов действия. В данной работе мы представляем подробный протокол с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователю улучшить свои навыки по разделению спинного мозга и поддержанию жизнеспособности клеток, чтобы беспрепятственно изучить электрический механизм СКС на двигательном нейроне и избежать ненужных проб и ошибок.

Введение

Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Andreas Rowald et al. сообщили, что SCS обеспечивает функцию опорно-двигательного аппарата и туловища нижних конечностей в течение одного дня¹. Изучение биологического механизма СКС для восстановления опорно-двигательного аппарата является важной и актуальной областью исследований для разработки более точной стратегии СКС. Например, команда Грегуара Куртина продемонстрировала, что возбуждающий интернейрон Vsx2 и нейроны Hoxa10 в спинном мозге являются ключевыми нейронами для ответа на SCS, а клеточно-специфическая нейромодуляция....

протокол

Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил все эксперименты на животных, и исследования были проведены в соответствии с соответствующими правилами защиты животных.

1. Подготовка животных

1. Животные
   1. Информация о содержании: Домашние крысы-самцы Спрэга-Доули (послеродовой период 10-14 дней, P10-P14) в специфической среде, свободной от патогенов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия в помещении поддерживались на уровне 20 °C ± 2 °C, влажность: 50%-60%, с 12-часовым циклом света/темноты. Животные имели свободный доступ к пище и воде.
   2. Ретроградная маркировка двигательных нейронов: инъе....

Результаты

Благодаря строгому низкотемпературному поддержанию во время тонкой работы (дополнительный рисунок 1, дополнительный рисунок 2 и рисунок 1) жизнеспособность ячейки была достаточно хорошей, чтобы выполнять последующие электрофизиологические записи. Чтобы макс?.......

Обсуждение

Информация о движении, модулированная СКС, наконец, конвергентна к двигательным нейронам. Таким образом, использование двигательных нейронов в качестве объекта исследования может упростить дизайн исследования и более непосредственно раскрыть механизм нейромодуляции СКС. Для одновр?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2