척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

요약

이 프로토콜은 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 분해능으로 척수 자극(SCS)에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 방법을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 척수를 분리하고 세포 생존력을 동시에 유지하는 기술을 향상시킬 수 있습니다.

초록

척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 운동 뉴런은 감각 운동 행동을 실행하는 최종 단위이기 때문에 SCS로 운동 뉴런의 전기 반응을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 이 목표를 달성하는 데에는 세포 생존력 유지, 뼈 구조에서 척수를 빠르게 분리, SCS를 사용하여 활동 전위를 성공적으로 유도하는 등 몇 가지 복잡한 어려움이 여전히 있습니다. 여기에서는 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 해상도로 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 상세한 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 연구자가 척수 분리 및 세포 생존력 유지 기술을 향상시켜 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있습니다.

서문

척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 안드레아스 로왈드(Andreas Rowald) 등은 SCS가 단 하루 만에 하지 운동과 몸통 기능을 가능하게 한다고 보고했다¹. 운동 회복을 위한 SCS의 생물학적 메커니즘을 탐구하는 것은 보다 정확한 SCS 전략을 개발하기 위한 중요하고 추세적인 연구 분야입니다. 예를 들어, 그레구아르 쿠르틴(Grégoire Courtine)의 연구팀은 척수의 흥분성 Vsx2 인터뉴런과 Hoxa10 뉴런이 SCS에 반응하는 핵심 뉴런이며, SCI² 이후 쥐의 보행 능력을 회복하기 위해 세포 특이적 신경조절이 가능하다는 것을 입증했습니다. 그러나 단일 셀 규모에서 SCS의 전기적 메커니즘에 초점을 맞춘 연구는 거의 없습니다. 고전적인 오징어 실험 ^3,4,5에서 초임계 직류 자극이 활동 전위(AP)를 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있지만, SCS와 같은 펄스 교류 전기 자극이 모터 신호 생성에 어떤 영향을 미치는지는 여전히 불분명합니다.

척추 내 신경 회로의 복잡성을 감안할 때, 세포 집단에 대한 적절한 선택은 SCS의 전기적 메커니즘을 조사하는 데 중요합니다. SCS는 고유수용성 경로(proprioceptive pathway)6를 활성화시킴으로써 운동기능을 회복시키지만, 운동뉴런(motor neuron)은 고유수용감각 정보 구심성 입력⁽affrioception information afferent input)⁷의 통합으로부터 유도된 운동 명령을 실행하는 최종 단위이다. 따라서 SCS를 사용하여 운동 뉴런의 전기적 특성을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

아시다시피, 패치 클램프는 매우 높은 시공간 분해능(spatiotemporal resolution⁾⁸을 가진 세포 전기생리학적 기록을 위한 황금 표준 방법입니다. 따라서 본 연구에서는 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하기 위해 패치 클램프를 사용하는 방법을 설명합니다. 뇌 패치-클램프(⁹)와 비교했을 때, 척수 패치-클램프는 다음과 같은 이유로 더 어렵다: (1) 척수는 아주 작은 부피의 척추관에 의해 보호되며, 이는 더 나은 세포 생존력을 얻기 위해 매우 미세한 미세 조작과 엄격한 얼음처럼 차가운 유지가 필요하다. (2) 척수가 너무 가늘어서 절단 트레이에 고정할 수 없기 때문에 저융점 아가로스에 담그고 응고 후 다듬어야 합니다.

따라서 이 방법은 척수를 해부하고 동시에 세포 생존력을 유지하는 데 있어 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있는 기술적 세부 사항을 제공합니다.

프로토콜

기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 실험을 승인했으며 연구는 관련 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 준비

1. 마리
   1. 주거 정보: 수컷 Sprague-Dawley 쥐(출생 후 10-14일, P10-P14)를 특정 병원체가 없는 환경에서 사육합니다.
      알림: 실내 조건은 20°C ± 2°C, 습도: 50%-60%, 12시간 밝음/어두움 주기로 유지되었습니다. 동물들은 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있었다.
   2. 운동 뉴런을 역행적으로 라벨링: Fluoro-Gold(FG)를 양측 경골 전방 및 비복근(멸균 식염수 2%, 근육당 50μL)에 주입하여 희생 2일 전에 운동 뉴런을 역행적으로 라벨링합니다.
2. 솔루션
   1. 절단 용액 준비: 혼합 120 mM 염화 콜린, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3 , 1.25 mM NaH 2 PO₄ , 0.5 mM CaCl 2 , 7 mM MgCl_{2 , 1.3} mM 아스코르브 산, 15 mM 포도당. 해부 및 슬라이싱 전에 95 % O 2 및 5 % CO₂ (KOH로 pH 7.4로 조정)로 용액을 30 분 동안 사전 거품으로 만듭니다. 으깬 얼음으로 용액을 식히십시오.
   2. 인공 뇌척수액(ACSF) 제조: 126mM NaCl, 3mM KCl, 1.2mM NaH2PO4를 혼합합니다. 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ 및 10 mM 글루코스. 배양 전에 30분 동안 95% O2 및 5%_CO2로 용액을 사전 거품화합니다.
   3. 세포 내 용액 준비: 126mM K-글루코네이트, 2mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2mM EGTA, 10mM HEPES, 4mM Na 2 ATP, 0.4mM Na₂GTP, 10mM K-포스포크레아틴 및 0.5% 뉴로비오틴(pH 7.25 및 305mOsm/Kg)을 혼합합니다. 으깬 얼음으로 용액을 식히십시오.
   4. 저융점 아가로스 겔 준비: 절단액 100mL에 아가로스 4g을 녹이고 자기 교반 로터를 사용하여 완전히 녹입니다. 매립 전 30분에 저융점 아가로스를 전자레인지에서 고출력으로 1분 동안 가열한 후 39°C 수조에 옮겨 액체 상태를 유지합니다.
3. 기기 준비
   1. 관류 전 1분에 으깬 얼음을 관류 트레이(보충 그림 10A)에 놓습니다. 해부학적 트레이(보충 그림 1B)와 절단 트레이(보충 그림 1C)를 물 밴드가 있는 -80°C의 밤새 미리 놓습니다.
   2. 나일론 메쉬가 있는 배양 챔버를 45°C의 오븐에 미리 밤새 넣습니다.
   3. 저융점 아가로스를 사용하여 35° 경사면과 2mm 두께의 플랫폼을 사전 제작합니다(보충 그림 1D). 겔 응고 후 35mm 페트리 접시 중앙에 놓아 다음 절차에서 척수를 지지합니다.
4. 심내 관류
   1. 복강 내 주사를 통해 2.5% 트리브로모에탄올(160μL/10g)로 쥐를 마취합니다. 발가락을 부드럽게 꼬집는 것과 같은 외부 자극에 대한 반응 부족을 확인하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
   2. 적절한 마취가 확인되면 쥐를 누운 상태로 놓고 실리카겔로 채워진 페트리 접시에 고정시킵니다.
   3. 5mm 세로 피부 절개를 시푸이드 돌기까지 꼬리로 자른 다음 피하 공간을 완전히 확장합니다. 복부 정중선을 따라 2cm의 세로 피부 절개를 잘라 위에서 언급한 절개부부터 가슴 상단까지 외흉벽을 완전히 노출시킵니다.
   4. 톱니가 있는 핀셋을 사용하여 시포이드를 들어 올린 다음 (보충 그림 2A) 가는 가위를 사용하여 횡격막을 자릅니다. 흉부를 열고 심장을 노출시키기 위해 xiphoid 돌기의 양쪽을 따라 흉골을 절단합니다(보충 그림 2B).
      알림: 양쪽의 내부 흉부를 보존하도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 대량 출혈을 유발할 수 있습니다.
   5. 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 좌심실을 들어 올립니다. 좌심실의 세로축을 따라 좌심실 정점에 22G 바늘을 삽입합니다(보충 그림 2C). 한편, 관류관에서 리드미컬한 혈액 맥동을 관찰하거나 바늘이 우심실에 구멍을 뚫어 관류 효과가 좋지 않을 수 있습니다.
      알림: 톱니가 있는 핀셋을 사용해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 핀셋 고정 부위에서 여분의 혈액이 누출될 수 있습니다.
   6. 가는 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 자른 다음(보충 그림 2C) 1분 이내에 약 2mL/s의 속도로 100mL의 얼음처럼 차가운 관류액을 수동으로 주입합니다.
      알림: 쥐의 간과 발이 창백해지고 우심방에서 혈액이 흐르지 않으면 좋은 관류를 얻을 수 있습니다.
5. 척수 박리(그림 1)
   1. 쥐를 엎드린 자세로 놓고 앞쪽 상장골 척추(약 L4 척추 수준)와 흉두의 만곡 이동점(약 T6 척추 수준)에서 각각 척추를 자릅니다(그림 1A). 그런 다음 즉시 분리된 척추를 산소가 공급된 얼음처럼 차가운 관류 용액에 넣어 잔류 혈액과 지방 조직을 씻어냅니다. 이 절차는 후속 절차에서 수술 필드를 깨끗하게 유지하는 데 유용합니다.
      참고: 척추 주위 근육은 예약되어야 하며, 이는 곤충 핀을 사용하여 척추를 고정하는 데 도움이 됩니다.
   2. 즉시 분리된 척추를 등쪽이 위로 향하게 하고 끝이 작업자에 가깝게 하여 해부학적 트레이(그림 1B)로 옮깁니다. 해부학적 트레이를 50mL의 연속 산소가 공급되는 얼음 저온 절단 용액으로 채웁니다(그림 1B).
   3. 4개의 곤충 핀을 사용하여 척추 주위 근육을 관통하여 척추를 고정합니다(그림 1B).
   4. 해부 현미경으로 "후궁 절제술"이라고 할 수 있는 마이크로 가위로 양쪽 척추경을 연단 끝에서 자릅니다(그림 1C). 척수가 손상되지 않도록 주의하십시오. 한편, 마이크로 톱니 핀셋을 사용하여 절단된 척추체를 들어 올립니다.
   5. 후궁 절제술 후에는 척수를 척수에서 즉시 분리하지 마십시오. 대신 마이크로 가위를 사용하여 등쪽 정중선을 따라 경막을 자르면 세포와 산소가 공급된 ACSF 사이의 영양분 흡수에 도움이 됩니다(그림 1D).
      알림: 경막을 절대 찢지 마십시오. 마이크로 가위로 경막을 자르는 것만 허용됩니다. 그렇지 않으면 신경근과 척추 실질이 심각하게 손상됩니다!
   6. 척수의 부분을 들어 올린 다음 약 1mm를 남겨두고 신경근을 조심스럽게 자릅니다(그림 1E). 척추관에서 척수를 분리한 후 2개의 곤충 핀을 사용하여 복부 쪽이 위로 향하도록 척수를 고정합니다(그림 1F).
   7. 마이크로 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 경막을 자릅니다(그림 1F). 여분의 신경근을 약 1mm 남겨두고 잘라냅니다.
      참고: 신경은 척수보다 훨씬 더 끈질깁니다. 예약된 신경근이 너무 길면(>1mm) 진동체가 신경근을 절단할 수 없어 척추 실질이 심각하게 찢어질 수 있습니다.
   8. 마이크로 가위를 사용하여 요추 확대를 6-7mm 길이로 분리합니다(그림 1G).
6. 저융점 아가로스에 끼워넣기
   1. 등쪽이 위로 향하고 꼬리 끝이 아래로 향하도록 요추 확대를 35° 경사면(그림 1H)에 놓습니다. 흡수성 여과지를 사용하여 조직 표면의 풍부한 수분을 제거합니다(그림 1H).
   2. 녹은 아가로스 겔을 요추 확장이 포함된 페트리 접시에 천천히 붓습니다(그림 1I).
      알림: 너무 빨리 붓지 않으면 젤에 거품이 쌓일 수 있습니다.
   3. 위의 페트리 접시를 얼음물 혼합물에 넣어 가능한 한 빨리 젤을 식히면 세포 활동을 유지하는 데 도움이 됩니다.
   4. 겔을 15mm x 10mm x 10mm 정육면체로 자르고 초강력 접착제를 사용하여 표본 디스크에 장착합니다(그림 1J).
7. 깔 끔 히
   1. 시편 디스크를 미리 얼린 절단 트레이에 넣은 다음 얼음처럼 차가운 절단 용액을 붓습니다(그림 1K). 절단 트레이에 95 % CO 2 및 5 % O₂ 로 지속적으로 기포를 발생시킵니다.
   2. 진동 매개변수 설정: 두께: 350μm; 속도: 0.14-0.16mm/s, 진폭: 1.0mm, 진동 주파수: 85Hz.
   3. 한 마리당 2-3개의 적당한 조각을 수확하십시오. 동물당 5-6개의 세포 범위로 조각당 1-2개의 건강한 FG+ 운동 뉴런을 기록합니다.
8. 잠복
   1. 덮개 슬라이드 핀셋을 사용하여 슬라이스를 자르고(그림 1L) 지속적으로 산소가 공급되는 ACSF로 채워진 배양 챔버에 넣습니다. 배양 챔버를 32°C의 수조에 30분 동안 넣은 다음 기록하기 전에 실온(RT)에서 30분 더 배양합니다.
      참고: 마취에서 첫 번째 절편을 얻는 것까지 위의 절차는 세포의 생존력을 최대한 유지하기 위해 20-30분 이내에 완료되어야 합니다. 각 슬라이스의 운동 뉴런은 약 6-7시간 동안 생존력을 유지할 수 있습니다.

2. SCS를 사용한 패치 클램프 기록(그림 2)

1. 준비
   1. 약 1-2mL/분의 속도로 연속적으로 기포된 ACSF로 기록 챔버를 관류합니다. 연동 펌프의 제어판을 통해 유량을 개별적으로 조정합니다.
   2. 녹음실에 슬라이스를 놓습니다. 나일론 나사산이 있는 U자형 백금 와이어를 사용하여 슬라이스를 제자리에 단단히 고정합니다.
   3. 적외선 미분 간섭 대비 현미경(IR-DIC)을 사용하여 슬라이스를 관찰합니다. 4x 대물 렌즈 아래에서 등근의 길이가 약 1mm인지 확인합니다. 등쪽 뿌리가 실질로 들어가는 영역을 찾은 다음 중앙 시야를 이 영역으로 이동합니다.
   4. 펄스 발생기를 맞춤형 전극과 연결합니다(그림 2A).
2. SCS 구성
   1. micromanipulation 시스템을 통해 등쪽 정중선 근처에 SCS의 양극을 배치합니다(그림 2B).
   2. micromanipulation 시스템을 통해 SCS의 음극을 등근 진입 영역(DREZ) 근처에 배치합니다(그림 2B).
3. 세포 표적화 및 이미징
   1. IR-DIC를 10x 대물렌즈와 함께 사용하여 대부분의 운동 뉴런이 위치한 운동란의 배외측 영역을 대략적으로 찾습니다. 그런 다음 중앙 시야를 이 영역으로 이동합니다.
   2. 60x 대물렌즈로 전환하여 매끄럽고 밝은 표면과 보이지 않는 핵을 가진 건강한 뉴런을 찾습니다(그림 2C,F).
   3. IR 강도를 약간 낮추고 형광 광원을 켭니다. 광 필터를 광대역 자외선 여기 필터(그림 2D,G)로 전환하여 적절한 FG 양성(FG+) 운동 뉴런을 선택합니다(그림 2E,H).
   4. 흡입 전극을 사용하여 등근에 1x 모터 역치 자극을 가합니다. 운동 뉴런에서 유발된 활동 전위가 감지되면(보충 그림 3), 등쪽 뿌리의 활동이 온전하다는 것을 확인합니다. 그렇지 않은 경우 이 조각을 삭제해야 합니다.
4. 패치 클램프 기록
   1. 마이크로피펫에 세포 내 용액을 채우고 전극 홀더에 삽입합니다. micromanipulation 시스템을 사용하여 피펫을 ACSF 항온조로 내립니다. 피펫 저항 범위는 5-8MΩ입니다.
   2. 피펫에 소량의 양압을 가하여 먼지와 세포 파편을 날려 버립니다.
      1. 전극을 내려 셀에 접근합니다. 피펫이 FG+ 뉴런의 표면에 닿으면 팁 수준에서 멤브레인의 작은 움푹 들어간 곳이 보입니다. 양압을 해제하십시오.
      2. 그런 다음 주사기를 사용하여 피펫에 소량의 음압을 가합니다. 이것은 세포막을 유리 피펫과 접촉하도록 당기는 소량의 흡입을 생성합니다. 저항 값이 기가옴(>1GΩ)으로 증가할 때까지 소프트웨어 인터페이스의 총 저항에 항상 주의하십시오. 그런 다음 gigaseal이 형성됩니다.
   3. 멤브레인 전위를 -70mV로 고정한 다음 증폭기의 소프트웨어 인터페이스에서 빠른 커패시턴스 보상 버튼을 누릅니다. 일시적으로 음압을 가하여 세포막을 파열시킨 다음 증폭기의 소프트웨어 인터페이스에서 느린 커패시턴스 보상 버튼을 누릅니다. 이 시점에서, 양호한 전체 세포 구성이 얻어진다.
   4. 소프트웨어 인터페이스에서 IC 버튼을 클릭하여 전류 클램프 모드로 전환하고 휴지막 전위(RMP)를 기록합니다.
   5. 진폭이 1-10mA인 상태에서 1-2초 동안 SCS를 적용하고 펄스 폭과 주파수는 각각 210μs 및 40Hz로 고정합니다. 첫 번째 AP가 관찰될 때까지 자극 진폭을 천천히 증가시켜 모터 임계값을 결정합니다.
   6. 전류 클램프 모드^10,11,12에서 레오베이스 주위에 5s 탈분극 전류 주입을 사용하여 지연 및 즉시 발화 모터 뉴런을 구별합니다. 즉시 발화 운동 뉴런: 낮은 rheobase는 안정적인 발화 빈도로 즉각적이고 반복적인 발화를 유도할 수 있습니다. 지연된 발화 운동 뉴런: 높은 유변염기는 가속 발화 속도로 반복적인 발화를 위해 지연된 개시를 유도할 수 있습니다(그림 3).
   7. SCS가 꺼지면 자발적인 AP 발사를 캡처하기 위한 멤브레인 전위를 계속 기록합니다.
   8. SCS가 켜지고 꺼질 때 여기성 시냅스후 전류(EPSC)에 대한 전압 클램프 기록, 전압 클램프 기록을 수행합니다. 자극 파라미터는 1x 모터 임계값, 210μs, 2Hz입니다.

결과

미세 작동 중 엄격한 저온 유지 덕분에(보충 그림 1, 보충 그림 2 및 그림 1) 세포 생존율은 후속 전기생리학적 기록을 수행하기에 충분했습니다. 임상 시나리오를 최대한 시뮬레이션하기 위해 미세 조작을 사용하여 SCS 음극과 양극을 각각 등쪽 정중선과 DREZ 근처에 배치했으며(그림 2), 등쪽 뿔에서 신경 신호를 시작하여 운동 기둥의 배외측...

토론

SCS에 의해 조절된 운동 정보는 최종적으로 운동 뉴런으로 수렴됩니다. 따라서 운동 뉴런을 연구 목표로 삼으면 연구 설계를 단순화하고 SCS의 신경 조절 메커니즘을 보다 직접적으로 밝힐 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 세포 생존력을 유지하는 방법, 뼈 구조에서 척?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2