脊髓切片 的离体 制备，用于脊髓刺激过程中运动神经元的全细胞膜片钳记录

摘要

该协议描述了一种使用膜片钳研究运动神经元对脊髓刺激（SCS）的电反应的方法，具有高时空分辨率，这可以帮助研究人员提高分离脊髓和同时维持细胞活力的技能。

摘要

脊髓刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。由于运动神经元是执行感觉运动行为的最终单位，因此直接研究SCS运动神经元的电反应可以帮助我们理解脊髓运动调节的底层逻辑。为了同时记录不同的刺激特征和细胞反应，膜片钳是在单细胞尺度上研究电生理特征的好方法。然而，实现这一目标仍然存在一些复杂的困难，包括维持细胞活力、快速将脊髓与骨结构分离，以及利用SCS成功诱导动作电位。在这里，我们提出了一个详细的方案，使用膜片钳以高时空分辨率研究运动神经元对SCS的电反应，这可以帮助研究人员提高分离脊髓和维持细胞活力的技能，以顺利研究SCS对运动神经元的电机制，避免不必要的试验和错误。

引言

脊髓刺激（SCS）可有效恢复脊髓损伤（SCI）后的运动功能。Andreas Rowald 等人报告说，SCS 在一天内实现了下肢运动和躯干功能¹.探索SCS对运动恢复的生物学机制是制定更精确的SCS策略的关键和趋势研究领域。例如，Grégoire Courtine的团队证明，脊髓中的兴奋性Vsx2中间神经元和Hoxa10神经元是响应SCS的关键神经元，细胞特异性神经调控在SCI²后恢复大鼠行走能力是可行的。然而，很少有研究关注单细胞尺度上SCS的电机制。尽管众所周知，超阈值直流电刺激可以引发经典鱿鱼实验^3,4,5中的动作电位（AP），但脉冲交变电刺激（如SCS）如何影响运动信号的产生仍不清楚。

鉴于脊髓内神经回路的复杂性，适当选择细胞群对于研究SCS的电机制非常重要。尽管 SCS 通过激活本体感受通路⁶ 来恢复运动功能，但运动神经元是执行运动命令的最终单元，该命令来自整合本体感受信息传入输入⁷。因此，直接用SCS研究运动神经元的电特性可以帮助我们理解脊髓运动调节的底层逻辑。

研究方案

机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验，研究是按照相关的动物福利法规进行的。

1. 动物准备

1. 动物
   1. 饲养信息：在特定的无病原体环境中饲养雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后10-14天，P10-P14）。
      注意：室温保持在20°C±2°C，湿度：50%-60%，光/暗循环12小时。动物可以自由获得食物和水。
   2. 逆行标记运动神经元：将氟金（FG）注射到双侧胫骨前肌和腓肠肌中（在无菌盐水中2%，每块肌肉50μL）以在处死前2天逆行标记运动神经元。
2. 解决 方案
   1. 制备切割溶液：混合 120 mM 氯化胆碱、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO 3、1.25 mM NaH 2 PO₄、0.5 mM CaCl 2、7 mM MgCl₂、_1.3 mM 抗坏血酸、15 mM 葡萄糖。在解剖和切片之前，用95%O 2和5%CO₂（用KOH调节至pH 7.4）预起泡溶液30分钟。用碎冰冷却溶液。
   2. 制备人工脑脊液（ACSF）：混合126mM NaCl，3mM KCl，1.2mM NaH₂PO 4;1.3 mM MgCl 2、2.4 m....

讨论

SCS调制的运动信息最终收敛到运动神经元。因此，以运动神经元为研究靶点可以简化研究设计，更直接地揭示SCS的神经调控机制。为了同时记录不同的刺激特征和细胞反应，膜片钳是在单细胞尺度上研究电生理特征的好方法。然而，仍然存在一些困难，包括如何保持细胞活力，如何快速将脊髓与骨结构分离，以及如何利用SCS成功诱导APs。因此，本研究旨在帮助研究人员快速掌握基本的操作技能，?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2