La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

Abstract

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Poiché i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire i comportamenti sensomotori, studiare direttamente le risposte elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante della modulazione motoria spinale. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà complesse nel raggiungere questo obiettivo, tra cui il mantenimento della vitalità cellulare, la rapida separazione del midollo spinale dalla struttura ossea e l'utilizzo dell'SCS per indurre con successo potenziali d'azione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni a SCS con un'elevata risoluzione spaziotemporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere la vitalità cellulare allo stesso tempo per studiare senza problemi il meccanismo elettrico di SCS sul motoneurone ed evitare inutili tentativi ed errori.

Introduzione

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Andreas Rowald et al. hanno riportato che la SCS consente la funzione locomotoria e del tronco degli arti inferiori entro un solo giorno¹. L'esplorazione del meccanismo biologico della SCS per il recupero locomotore è un campo di ricerca critico e di tendenza per lo sviluppo di una strategia SCS più precisa. Ad esempio, il team di Grégoire Courtine ha dimostrato che l'interneurone eccitatorio Vsx2 e i neuroni Hoxa10 nel midollo spinale sono i neuroni chiave per la risposta alla SCS e la neuromodulazione cellulo-specifica è fattibile per ripristinare la capacità di camminare del ratto dopo la lesione midollare². Tuttavia, pochi studi si concentrano sul meccanismo elettrico della SCS su scala di una singola cellula. Sebbene sia ben noto che lo stimolo in corrente continua soprasoglia può suscitare i potenziali d'azione (AP) nel classico esperimento del calamaro ^3,4,5, non è ancora chiaro come la stimolazione elettrica alternata pulsata, come la SCS^, influenzi la generazione del segnale motorio.

Data la complessità dei circuiti neurali intraspinali, una selezione appropriata per la popolazione cellulare è importante per studiare il meccanismo elettrico della SCS. Sebbene la SCS ripristini la funzione motoria attivando la via propriocettiva⁶, i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire il comando motorio, derivato dall'integrazione dell'input afferente alle informazioni sulla propriocezione⁷. Pertanto, studiare direttamente le caratteristiche elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante alla modulazione motoria spinale.

Come sappiamo, il patch-clamp è il metodo gold standard per la registrazione elettrofisiologica cellulare con una risoluzione spazio-temporale estremamente elevata⁸. Pertanto, questo studio descrive un metodo che utilizza un patch clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla SCS. Rispetto al cerotto cerebrale⁹, il cerotto per il midollo spinale è più difficile per i seguenti motivi: (1) Il midollo spinale è protetto dal canale vertebrale con un volume minuscolo, che richiede una micromanipolazione molto fine e una rigorosa manutenzione ghiacciata per ottenere una migliore vitalità cellulare. (2) Poiché il midollo spinale è troppo sottile per essere fissato sul vassoio di taglio, deve essere immerso in agarosio a basso punto di fusione e tagliato dopo la solidificazione.

Quindi, questo metodo fornisce dettagli tecnici nella dissezione del midollo spinale e nel mantenimento della vitalità cellulare allo stesso tempo, in modo da studiare senza problemi il meccanismo elettrico della SCS sui motoneuroni ed evitare inutili prove ed errori.

Protocollo

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali e gli studi sono stati condotti in conformità con le normative vigenti in materia di benessere degli animali.

1. Preparazione degli animali

1. Animali
   1. Informazioni sull'alloggiamento: Ratti Sprague-Dawley maschi (10-14 giorni postnatali, P10-P14) in un ambiente specifico privo di agenti patogeni.
      NOTA: Le condizioni ambientali sono state mantenute a 20 °C ± 2 °C, umidità: 50%-60%, con un ciclo luce/buio di 12 ore. Gli animali avevano libero accesso al cibo e all'acqua.
   2. Etichettare i motoneuroni retrogradamente: iniettare fluoro-oro (FG) nel muscolo bilaterale tibiale anteriore e gastrocnemio (2% in soluzione fisiologica sterile, 50 μL per muscolo) per marcare retrogradamente i motoneuroni 2 giorni prima del sacrificio.
2. Soluzioni
   1. Preparare la soluzione di taglio: mescolare 120 mM di cloruro di colina, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO₄, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl₂, _1,3 mM di acido ascorbico, 15 mM di glucosio. Pre-bolle la soluzione con il 95% di O 2 e il 5% di CO₂ (regolare a pH 7,4 con KOH) per 30 minuti prima della dissezione e dell'affettatura. Raffreddare la soluzione con ghiaccio tritato.
   2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF): Mescolare 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH₂PO4; 1,3 mM di MgCl 2, 2,4 mM di CaCl₂, 26 mM di NaHCO₃ e 10 mM di glucosio. Pre-bolle la soluzione con il 95% di O 2 e il 5% di CO₂ per 30 minuti prima dell'incubazione.
   3. Preparare la soluzione intracellulare: Mescolare 126 mM di K-gluconato, 2 mM KCl, 2 mM di MgCl 2, 0,2 mM di EGTA, 10 mM di HEPES, 4 mM di Na 2 ATP, 0,4 mM di Na₂GTP, 10 mM di K-fosfocreatina e 0,5% di Neurobiotina (pH 7,25 e 305 mOsm/Kg). Raffreddare la soluzione con ghiaccio tritato.
   4. Preparare il gel di agarosio a basso punto di fusione: sciogliere 4 g di agarosio in 100 ml di soluzione da taglio e utilizzare un rotore di agitazione magnetico per scioglierlo completamente. A 30 minuti prima dell'incorporazione, riscaldare l'agarosio a basso punto di fusione nel forno a microonde ad alta potenza per 1 minuto, quindi trasferirlo a bagnomaria a 39 °C per mantenere lo stato liquido.
3. Preparazione dello strumento
   1. Posizionare il ghiaccio tritato sul vassoio di perfusione (Figura supplementare 1A) 10 minuti prima della perfusione. Posizionare il vassoio anatomico (Figura supplementare 1B) e il vassoio di taglio (Figura supplementare 1C) con una fascia d'acqua a -80 °C durante la notte in anticipo.
   2. Mettere la camera di incubazione con rete di nylon in forno a 45 °C per una notte in anticipo.
   3. Utilizzare agarosio a basso punto di fusione per prefabbricare una pendenza di 35° e una piattaforma di 2 mm di spessore (Figura supplementare 1D). Dopo la solidificazione del gel, posizionarli al centro di una capsula di Petri da 35 mm per sostenere il midollo spinale nelle successive procedure.
4. Perfusione intracardica
   1. Anestetizzare i ratti con tribromoetanolo al 2,5% (160 μL/10 g) tramite iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che i ratti siano completamente anestetizzati verificando la mancanza di risposta agli stimoli esterni, come un leggero pizzicotto del dito del piede.
   2. Quando l'anestesia corretta è confermata, posizionare i ratti in posizione supina e immobilizzarli nella capsula di Petri riempita di gel di silice.
   3. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 5 mm caudalmente al processo xifoideo, quindi espandere completamente lo spazio sottocutaneo. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 2 cm lungo la linea mediana ventrale per esporre completamente la parete toracica esterna, iniziando con l'incisione sopra menzionata e terminando con la parte superiore del torace.
   4. Utilizzare una pinzetta dentata per sollevare lo xifoide (Figura supplementare 2A), quindi utilizzare forbici sottili per tagliare il diaframma. Tagliare lo sterno lungo entrambi i lati del processo xifoideo per aprire il torace ed esporre il cuore (Figura 2B supplementare).
      NOTA: Fare attenzione a preservare i vasi toracici interni su entrambi i lati; in caso contrario, potrebbe causare un'emorragia massiccia.
   5. Usa una pinzetta senza denti per sollevare il ventricolo sinistro. Inserire un ago da 22 G nell'apice ventricolare sinistro lungo l'asse longitudinale del ventricolo sinistro (Figura 2C supplementare). Nel frattempo, osserva la pulsazione ritmica del sangue nel tubo di perfusione, altrimenti l'ago potrebbe perforare il ventricolo destro, il che potrebbe portare a uno scarso effetto di perfusione.
      NOTA: La pinzetta dentata non deve essere utilizzata; in caso contrario, potrebbe causare ulteriori perdite di sangue dal sito di tenuta della pinzetta.
   6. Utilizzare forbici sottili per tagliare l'atrio destro (Figura supplementare 2C), quindi iniettare manualmente 100 ml di fluido perfusivo ghiacciato a una velocità di circa 2 ml/s entro 1 minuto.
      NOTA: Quando il fegato e le zampe dei ratti impallidiscono e il sangue non fuoriesce dall'atrio destro, è possibile ottenere una buona perfusione.
5. Dissezione del midollo spinale (Figura 1)
   1. Posizionare il ratto in posizione prona e tagliare la colonna vertebrale rispettivamente in corrispondenza della spina iliaca anteriore superiore (circa il livello vertebrale L4) e del punto di spostamento della curvatura della colonna toracica (circa il livello vertebrale T6) (Figura 1A). Quindi, posizionare immediatamente la colonna vertebrale isolata nella soluzione di perfusione ghiacciata ossigenata per lavare via il sangue residuo e il tessuto adiposo; Questa procedura è utile per mantenere pulito il campo operatorio nelle procedure successive.
      NOTA: I muscoli paraspinali devono essere riservati, il che favorisce la successiva fissazione della colonna vertebrale utilizzando una spilla per insetti.
   2. Trasferire immediatamente la colonna vertebrale isolata nel vassoio anatomico (Figura 1B) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità rostrale vicino all'operatore. Riempire il vassoio anatomico con 50 ml di soluzione da taglio ghiacciata continuamente ossigenata (Figura 1B).
   3. Utilizzare quattro spilli per insetti per fissare la colonna vertebrale penetrando nei muscoli paraspinali (Figura 1B).
   4. Sotto il microscopio di dissezione, tagliare i peduncoli vertebrali di entrambi i lati dall'estremità rostrale con la microforbice, che può essere definita "laminectomia" (Figura 1C). Prestare attenzione a non danneggiare il midollo spinale. Nel frattempo, usa le pinzette micro-dentate per sollevare il corpo vertebrale tagliato.
   5. Dopo la laminectomia, non separare immediatamente il midollo spinale dal canale spinale. Invece, usa una microforbice per tagliare la dura madre lungo la linea mediana dorsale, che favorisce l'assorbimento dei nutrienti tra le cellule e l'ACSF ossigenato (Figura 1D).
      NOTA: Non strappare mai la dura madre. È consentito solo tagliare la dura madre con microforbici; in caso contrario, la radice nervosa e il parenchima spinale saranno seriamente danneggiati!
   6. Sollevare la parte rostrale del midollo spinale, quindi tagliare con cura la radice nervosa riservando circa 1 mm (Figura 1E). Dopo aver separato il midollo spinale dal canale vertebrale, utilizzare 2 spilli per insetti per fissare il midollo spinale con il lato ventrale rivolto verso l'alto (Figura 1F).
   7. Usa una microforbice per tagliare la dura madre lungo la linea mediana ventrale (Figura 1F). Tagliare le radici nervose ridondanti con circa 1 mm di riserva.
      NOTA: Il nervo è molto più tenace del midollo spinale. Se la radice nervosa riservata è troppo lunga (>1 mm), il vibratomo non può tagliare la radice nervosa, il che può portare a una grave lacerazione del parenchima spinale.
   8. Utilizzare una microforbice per separare l'allargamento lombare a una lunghezza di 6-7 mm (Figura 1G).
6. Incorporazione nell'agarosio a basso punto di fusione
   1. Posizionare l'allargamento lombare sulla pendenza di 35° (Figura 1H) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità caudale verso il basso. Utilizzare una carta assorbente da filtro per rimuovere l'abbondante acqua sulla superficie del tessuto (Figura 1H).
   2. Versare lentamente il gel di agarosio fuso nella capsula di Petri contenente l'allargamento lombare (Figura 1I).
      NOTA: Non versare troppo velocemente, altrimenti si accumuleranno bolle nel gel.
   3. Mettere la capsula di Petri di cui sopra nella miscela di acqua ghiacciata per raffreddare il gel il prima possibile, il che favorisce il mantenimento dell'attività delle cellule.
   4. Tagliare il gel in un cubo di 15 mm x 10 mm x 10 mm e montarlo sul disco del campione con supercolla (Figura 1J).
7. Affettamento
   1. Posizionare il disco portacampioni nel vassoio di taglio precongelato, quindi versare la soluzione di taglio ghiacciata (Figura 1K). Far bollire continuamente con il 95% di CO 2 e il 5% di O₂ nel vassoio di taglio.
   2. Impostare i parametri del vibratomo: spessore: 350 μm; velocità: 0,14-0,16 mm/s, ampiezza: 1,0 mm e frequenza di vibrazione: 85 Hz.
   3. Raccogli 2-3 fette adatte per animale. Registra 1-2 motoneuroni FG+ sani per fetta, con un intervallo di 5-6 cellule per animale.
8. Incubazione
   1. Utilizzare una pinzetta per vetrini di copertura per tagliare una fetta (Figura 1L) e posizionarla nella camera di incubazione riempita con ACSF continuamente ossigenato. Porre la camera di incubazione a bagnomaria a 32 °C per 30 minuti, quindi continuare a incubarla a temperatura ambiente (RT) per altri 30 minuti prima della registrazione.
      NOTA: Le procedure di cui sopra, dall'anestesia all'ottenimento della prima fetta, devono essere completate entro 20-30 minuti per mantenere il più possibile la vitalità delle cellule. I motoneuroni in ogni fetta possono mantenere la loro vitalità per circa 6-7 ore.

2. Registrazione patch-clamp con SCS (Figura 2)

1. Preparazioni
   1. Perfondere la camera di registrazione con ACSF a bolle continue ad una velocità di circa 1-2 mL/min. Regolare la portata individualmente tramite il pannello di controllo sulla pompa peristaltica.
   2. Posizionare una fetta nella camera di registrazione. Usa il filo di platino a forma di U con fili di nylon per stabilizzare saldamente la fetta in posizione.
   3. Utilizzare un microscopio a contrasto a interferenza differenziale infrarossa (IR-DIC) per osservare la fetta. Sotto l'obiettivo 4x, verificare che la lunghezza della radice dorsale sia di circa 1 mm. Trova l'area in cui la radice dorsale entra nel parenchima, quindi sposta il campo visivo centrale in quest'area.
   4. Collegare il generatore di impulsi con elettrodi personalizzati (Figura 2A).
2. Configurazione SCS
   1. Posizionare l'anodo di SCS vicino alla linea mediana dorsale tramite il sistema di micromanipolazione (Figura 2B).
   2. Posizionare il catodo di SCS vicino alla zona di ingresso della radice dorsale (DREZ) tramite il sistema di micromanipolazione (Figura 2B).
3. Targeting cellulare e imaging
   1. Usa IR-DIC con un obiettivo 10x trova approssimativamente la regione dorsolaterale della colonna motoria, dove si trova la maggior parte dei motoneuroni. Quindi, sposta il campo visivo centrale in quest'area.
   2. Passa a una lente dell'obiettivo 60x per trovare un neurone sano con una superficie liscia e luminosa e nuclei invisibili (Figura 2C,F).
   3. Abbassare leggermente l'intensità IR e accendere la sorgente luminosa a fluorescenza. Passare dal filtro della luce al filtro di eccitazione ultravioletta a banda larga (Figura 2D,G), per selezionare un motoneurone FG-positivo (FG+) appropriato (Figura 2E,H).
   4. Utilizzare elettrodi di aspirazione per applicare 1x stimolazione di soglia motoria alla radice dorsale. Se viene rilevato un potenziale d'azione evocato nei motoneuroni (Figura supplementare 3), ciò conferma che l'attività della radice dorsale è intatta. In caso contrario, questa fetta deve essere scartata.
4. Registrazione patch-clamp
   1. Riempire la micropipetta con la soluzione intracellulare e inserirla nel portaelettrodo. Utilizzare il sistema di micromanipolazione per abbassare la pipetta nel bagno ACSF. La resistenza della pipetta varia da 5 a 8 MΩ.
   2. Applicare una piccola quantità di pressione positiva alla pipetta per soffiare via la polvere e i detriti cellulari.
      1. Abbassare l'elettrodo per avvicinarlo alla cella. Quando la pipetta tocca la superficie del neurone FG+, una piccola rientranza della membrana diventa visibile a livello della punta. Rilasciare la pressione positiva.
      2. Quindi, applicare una piccola quantità di pressione negativa alla pipetta utilizzando una siringa. Questo crea una piccola quantità di aspirazione che tira la membrana cellulare a contatto con la pipetta di vetro. Prestare sempre attenzione alla resistenza totale sull'interfaccia software fino a quando il valore della resistenza non aumenta a gigaohm (>1 GΩ). Quindi, si forma il gigaseal.
   3. Bloccare il potenziale di membrana a -70 mV, quindi premere il pulsante di compensazione rapida della capacità sull'interfaccia software dell'amplificatore. Applicare delicatamente una pressione negativa transitoria per rompere la membrana cellulare, quindi premere il pulsante di compensazione della capacità lenta sull'interfaccia software dell'amplificatore. A questo punto, si ottiene una buona configurazione a cellula intera.
   4. Passare alla modalità di pinza amperometrica facendo clic sul pulsante IC sull'interfaccia software e registrare il potenziale di membrana a riposo (RMP).
   5. Applicare l'SCS per 1-2 s con l'ampiezza di 1-10 mA, mentre l'ampiezza e la frequenza dell'impulso sono fissate rispettivamente a 210 μs e 40 Hz. Determinare la soglia motoria aumentando lentamente l'ampiezza della stimolazione fino a quando non si osserva il primo AP.
   6. Distinguere i motoneuroni a fuoco ritardato e immediato utilizzando un'iniezione di corrente depolarizzante di 5 s attorno alla reobase nella modalità current-clamp^10,11,12. Motoneuroni a fuoco immediato: una bassa reobase può indurre un'accensione immediata e ripetitiva con una frequenza di attivazione stabile; Motoneuroni a fuoco ritardato: un'elevata base reometrica può indurre un'insorgenza ritardata per l'accensione ripetitiva con una velocità di attivazione accelerata (Figura 3).
   7. Quando SCS è disattivato, continuare a registrare il potenziale di membrana per l'acquisizione dell'attivazione spontanea degli AP.
   8. Eseguire registrazioni voltage-clamp registrazioni voltage-clamp per la corrente postsinaptica eccitatoria (EPSC) quando SCS è acceso e spento. Il parametro di stimolazione è 1x soglia motoria, 210 μs, 2 Hz.

Risultati

Grazie al rigoroso mantenimento a bassa temperatura durante l'operazione fine (Figura 1 supplementare, Figura 2 supplementare e Figura 1), la vitalità cellulare è stata sufficiente per eseguire successive registrazioni elettrofisiologiche. Per simulare il più possibile lo scenario clinico, abbiamo utilizzato la micromanipolazione per posizionare il catodo e l'anodo SCS vicino alla linea mediana dorsale e DREZ, rispettivamente (Figura 2), che ...

Discussione

Le informazioni di movimento modulate da SCS vengono infine condivise nei motoneuroni. Pertanto, prendere i motoneuroni come obiettivo di ricerca può semplificare il disegno dello studio e rivelare il meccanismo di neuromodulazione della SCS in modo più diretto. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà, tra cui come m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2