Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière

Résumé

Ce protocole décrit une méthode utilisant un patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière (SCS) avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences en séparant la moelle épinière et en maintenant la viabilité cellulaire simultanément.

Résumé

La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Étant donné que les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter les comportements sensori-moteurs, l’étude directe des réponses électriques des motoneurones avec SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il existe encore des difficultés complexes pour atteindre cet objectif, notamment le maintien de la viabilité cellulaire, la séparation rapide de la moelle épinière de la structure osseuse et l’utilisation du SCS pour induire avec succès des potentiels d’action. Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisant patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la SCS avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences dans la séparation de la moelle épinière et le maintien de la viabilité cellulaire en même temps pour étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur le motoneurone et éviter les essais et les erreurs inutiles.

Introduction

La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Andreas Rowald et al. ont rapporté que le SCS permet la fonction locomotrice et abdominale des membres inférieurs en un seul jour¹. L’exploration du mécanisme biologique de la SCS pour la récupération locomotrice est un domaine de recherche critique et en vogue pour le développement d’une stratégie SCS plus précise. Par exemple, l’équipe de Grégoire Courtine a démontré que l’interneurone excitateur Vsx2 et les neurones Hoxa10 de la moelle épinière sont les neurones clés de la réponse au SCS, et que la neur....

Protocole

Le Comité institutionnel sur les soins et l’utilisation des animaux a approuvé toutes les expériences sur les animaux et les études ont été menées conformément aux réglementations pertinentes en matière de bien-être animal.

1. Préparation des animaux

1. Animaux
   1. Informations sur le logement : Hébergez des rats Sprague-Dawley mâles (postnatal 10-14 jours, P10-P14) dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes.
      REMARQUE : Les conditions ambiantes ont été maintenues à 20 °C ± 2 °C, humidité : 50 % à 60 %, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les animaux avaient libre accès à la nourriture et à....

Discussion

L’information de mouvement modulée par SCS est finalement convergée vers les motoneurones. Par conséquent, prendre les motoneurones comme cible de recherche peut simplifier la conception de l’étude et révéler plus directement le mécanisme de neuromodulation du SCS. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il y .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2