Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière

Résumé

Ce protocole décrit une méthode utilisant un patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière (SCS) avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences en séparant la moelle épinière et en maintenant la viabilité cellulaire simultanément.

Résumé

La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Étant donné que les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter les comportements sensori-moteurs, l’étude directe des réponses électriques des motoneurones avec SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il existe encore des difficultés complexes pour atteindre cet objectif, notamment le maintien de la viabilité cellulaire, la séparation rapide de la moelle épinière de la structure osseuse et l’utilisation du SCS pour induire avec succès des potentiels d’action. Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisant patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la SCS avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences dans la séparation de la moelle épinière et le maintien de la viabilité cellulaire en même temps pour étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur le motoneurone et éviter les essais et les erreurs inutiles.

Introduction

La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Andreas Rowald et al. ont rapporté que le SCS permet la fonction locomotrice et abdominale des membres inférieurs en un seul jour¹. L’exploration du mécanisme biologique de la SCS pour la récupération locomotrice est un domaine de recherche critique et en vogue pour le développement d’une stratégie SCS plus précise. Par exemple, l’équipe de Grégoire Courtine a démontré que l’interneurone excitateur Vsx2 et les neurones Hoxa10 de la moelle épinière sont les neurones clés de la réponse au SCS, et que la neuromodulation spécifique aux cellules est réalisable pour restaurer la capacité de marche du rat après une lésion SCI². Cependant, peu d’études se concentrent sur le mécanisme électrique du SCS à l’échelle d’une seule cellule. Bien qu’il soit bien connu que le stimulus à courant continu supraseuil peut provoquer les potentiels d’action (PA) dans l’expérience classique du calmar ^3,4,5, la façon dont la stimulation électrique alternée pulsée, telle que SCS^, affecte la génération du signal moteur n’est pas encore claire.

Compte tenu de la complexité des circuits neuronaux intraspinaux, une sélection appropriée pour la population cellulaire est importante pour étudier le mécanisme électrique du SCS. Bien que le SCS restaure la fonction motrice en activant la voie proprioceptive⁶, les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter la commande motrice, dérivée de l’intégration de l’entrée afférente de l’information de proprioception⁷. Par conséquent, l’étude directe des caractéristiques électriques des motoneurones atteints de SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale.

Comme nous le savons, le patch-clamp est la méthode de référence pour l’enregistrement électrophysiologique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle extrêmement élevée⁸. Par conséquent, cette étude décrit une méthode utilisant une pince de patch pour étudier les réponses électriques des motoneurones au SCS. Par rapport au patch-clamp cérébral⁹, le patch-clamp de la moelle épinière est plus difficile pour les raisons suivantes : (1) La moelle épinière est protégée par le canal vertébral de petit volume, ce qui nécessite une micromanipulation très fine et un entretien rigoureux à froid glacé pour obtenir une meilleure viabilité cellulaire. (2) Parce que la moelle épinière est trop mince pour être fixée sur le plateau de coupe, elle doit être immergée dans de l’agarose à bas point de fusion et taillée après solidification.

Par conséquent, cette méthode fournit des détails techniques pour disséquer la moelle épinière et maintenir la viabilité cellulaire en même temps afin d’étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur les motoneurones et d’éviter les essais et les erreurs inutiles.

Protocole

Le Comité institutionnel sur les soins et l’utilisation des animaux a approuvé toutes les expériences sur les animaux et les études ont été menées conformément aux réglementations pertinentes en matière de bien-être animal.

1. Préparation des animaux

1. Animaux
   1. Informations sur le logement : Hébergez des rats Sprague-Dawley mâles (postnatal 10-14 jours, P10-P14) dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes.
      REMARQUE : Les conditions ambiantes ont été maintenues à 20 °C ± 2 °C, humidité : 50 % à 60 %, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les animaux avaient libre accès à la nourriture et à l’eau.
   2. Marquer les motoneurones rétrogradement : Injecter du Fluoro-Gold (FG) dans le tibial antérieur et le muscle gastrocnémien bilatéral (2 % dans une solution saline stérile, 50 μL par muscle) pour marquer rétrogradablement les motoneurones 2 jours avant le sacrifice.
2. Solutions
   1. Préparer la solution de coupe : Mélanger 120 mM de chlorure de choline, 2,6 mM de KCl, 26 mM de NaHCO 3, 1,25 mM de NaH 2 PO₄, 0,5 mM de CaCl 2, 7 mM de MgCl₂, _1,3 mM d’acide ascorbique, 15 mM de glucose. Pré-bullez la solution avec 95 % d’O 2 et 5 % de CO₂ (ajustez à un pH de 7,4 avec KOH) pendant 30 minutes avant la dissection et le tranchage. Refroidissez la solution avec de la glace pilée.
   2. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) : Mélanger 126 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM de NaH₂PO4 ; 1,3 mM de MgCl 2, 2,4 mM de CaCl₂, 26 mM de NaHCO₃ et 10 mM de glucose. Pré-buller la solution avec 95 % d’O2 et 5 % de CO₂ pendant 30 min avant l’incubation.
   3. Préparer la solution intracellulaire : Mélanger 126 mM de K-gluconate, 2 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2, 0,2 mM d’EGTA, 10 mM d’HEPES, 4 mM de Na 2 ATP, 0,4 mMde Na₂ GTP, 10 mM de K-phosphocréatine et 0,5 % de neurobiotine (pH 7,25 et 305 mOsm/Kg). Refroidissez la solution avec de la glace pilée.
   4. Préparez le gel d’agarose à bas point de fusion : Dissoudre 4 g d’agarose dans 100 mL de solution de coupe et utiliser un rotor d’agitation magnétique pour le dissoudre complètement. À 30 min avant l’enrobage, chauffer l’agarose à bas point de fusion dans le four à micro-ondes à haute puissance pendant 1 min, puis la transférer dans un bain-marie à 39 °C pour maintenir l’état liquide.
3. Préparation de l’instrument
   1. Placer la glace pilée sur le plateau de perfusion (figure supplémentaire 1A) 10 minutes avant la perfusion. Placez le plateau anatomique (figure supplémentaire 1B) et le plateau de coupe (figure supplémentaire 1C) avec une bande d’eau à -80 °C pendant la nuit à l’avance.
   2. Placez la chambre d’incubation avec un treillis en nylon dans le four à 45 °C pendant la nuit à l’avance.
   3. Utiliser de l’agarose à bas point de fusion pour préfabriquer une pente de 35° et une plate-forme de 2 mm d’épaisseur (figure supplémentaire 1D). Après la solidification du gel, placez-les au centre d’une boîte de Pétri de 35 mm pour soutenir la moelle épinière lors des prochaines procédures à venir.
4. Perfusion intracardique
   1. Anesthésier les rats avec 2,5 % de tribromoéthanol (160 μL/10 g) par injection intrapéritonéale. Assurez-vous que les rats sont complètement anesthésiés en vérifiant l’absence de réponse aux stimuli externes, tels qu’un léger pincement de l’orteil.
   2. Lorsque l’anesthésie correcte est confirmée, placez les rats en décubitus dorsal et immobilisez-les dans la boîte de Pétri remplie de gel de silice.
   3. Coupez une incision cutanée longitudinale de 5 mm dans le sens caudal jusqu’à l’apophyse xiphoïde, puis élargissez complètement l’espace sous-cutané. Coupez une incision cutanée longitudinale de 2 cm le long de la ligne médiane ventrale pour exposer complètement la paroi thoracique externe, en commençant par l’incision mentionnée ci-dessus et en terminant par le haut de la poitrine.
   4. Utilisez une pince à épiler dentée pour soulever le xiphoïde (figure supplémentaire 2A), puis utilisez des ciseaux fins pour couper le diaphragme. Coupez le sternum le long des deux côtés de l’apophyse xiphoïde pour ouvrir la poitrine et exposer le cœur (figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE : Veillez à préserver les vaisseaux thoraciques internes des deux côtés ; sinon, cela peut provoquer des saignements massifs.
   5. Utilisez une pince à épiler sans dents pour soulever le ventricule gauche. Insérez une aiguille de 22 G dans l’apex ventriculaire gauche le long de l’axe longitudinal du ventricule gauche (figure supplémentaire 2C). Pendant ce temps, observez la pulsation rythmique du sang dans le tube de perfusion, sinon l’aiguille peut perforer le ventricule droit, ce qui peut entraîner un mauvais effet de perfusion.
      REMARQUE : La pince à épiler dentée ne doit pas être utilisée ; sinon, cela peut provoquer une fuite de sang supplémentaire du site de maintien de la pince à épiler.
   6. À l’aide de ciseaux fins, couper l’oreillette droite (figure supplémentaire 2C), puis injecter manuellement 100 mL de liquide perfusant glacé à un débit d’environ 2 mL/s en 1 min.
      REMARQUE : Lorsque le foie et les pattes des rats pâlissent et qu’aucun sang ne s’écoule de l’oreillette droite, une bonne perfusion peut être obtenue.
5. Dissection de la moelle épinière (Figure 1)
   1. Placez le rat en position couchée et coupez la colonne vertébrale au niveau de l’épine iliaque antéro-supérieure (environ L4 niveau vertébral) et du point de déplacement de la courbure de la colonne thoracique (environ T6 niveau vertébral), respectivement (Figure 1A). Ensuite, placez immédiatement la colonne vertébrale isolée dans la solution perfusante glacée oxygénée pour éliminer les résidus de sang et de tissu adipeux ; Cette procédure est bénéfique pour garder le champ opératoire propre dans les procédures ultérieures.
      REMARQUE : Les muscles paraspinaux doivent être réservés, ce qui est propice à la fixation ultérieure de la colonne vertébrale à l’aide d’une épingle à insectes.
   2. Transférez immédiatement la colonne vertébrale isolée sur le plateau anatomique (Figure 1B) avec la face dorsale vers le haut et l’extrémité rostrale près de l’opérateur. Remplir le plateau anatomique avec 50 mL de solution de coupe glacée oxygénée en continu (figure 1B).
   3. Utilisez quatre épingles à insectes pour fixer la colonne vertébrale en pénétrant dans les muscles paraspinaux (figure 1B).
   4. Au microscope à dissection, coupez les pédicules vertébraux des deux côtés de l’extrémité rostrale avec le micro-ciseaux, ce que l’on peut appeler « laminectomie » (Figure 1C). Faites attention à ne pas endommager la moelle épinière. Pendant ce temps, utilisez la pince à épiler micro-dentée pour soulever le corps vertébral coupé.
   5. Après la laminectomie, ne séparez pas immédiatement la moelle épinière du canal rachidien. Au lieu de cela, utilisez un micro-ciseaux pour couper la dure-mère le long de la ligne médiane dorsale, ce qui est propice à l’absorption des nutriments entre les cellules et l’ACSF oxygéné (Figure 1D).
      REMARQUE : Ne déchirez jamais la dure-mère. Seule la coupe de la dure-mère par micro-ciseaux est autorisée ; sinon, la racine nerveuse et le parenchyme spinal seront gravement endommagés !
   6. Soulevez la partie rostrale de la moelle épinière, puis coupez soigneusement la racine nerveuse avec environ 1 mm réservé (Figure 1E). Après avoir séparé la moelle épinière du canal vertébral, utilisez 2 épingles à insectes pour fixer la moelle épinière avec le côté ventral vers le haut (Figure 1F).
   7. À l’aide d’un micro-ciseaux, couper la dure-mère le long de la ligne médiane ventrale (figure 1F). Coupez les racines nerveuses redondantes avec environ 1 mm réservé.
      REMARQUE : Le nerf est beaucoup plus tenace que la moelle épinière. Si la racine nerveuse réservée est trop longue (>1 mm), le vibratome ne peut pas couper la racine nerveuse, ce qui peut entraîner une déchirure grave du parenchyme rachidien.
   8. À l’aide d’un micro-ciseau, séparez l’élargissement lombaire d’une longueur de 6 à 7 mm (Figure 1G).
6. Enrobage dans l’agarose à bas point de fusion
   1. Placez l’élargissement lombaire sur la pente de 35° (Figure 1H) avec la face dorsale vers le haut et l’extrémité caudale vers le bas. Utilisez un papier filtre absorbant pour éliminer l’eau abondante à la surface du tissu (figure 1H).
   2. Versez lentement le gel d’agarose fondu dans la boîte de Pétri contenant l’hypertrophie lombaire (Figure 1I).
      REMARQUE : Ne versez pas trop vite ou des bulles s’accumuleront dans le gel.
   3. Placez la boîte de Pétri ci-dessus dans le mélange glace-eau pour refroidir le gel dès que possible, ce qui est propice au maintien de l’activité des cellules.
   4. Coupez le gel en un cube de 15 mm x 10 mm x 10 mm et montez-le sur le disque d’échantillon avec de la superglue (Figure 1J).
7. Trancher
   1. Placez le disque d’échantillon dans le plateau de coupe précongelé, puis versez la solution de coupe glacée (Figure 1K). Faire bouillonner continuellement avec 95 % de CO 2 et 5 % d’O₂ dans le plateau de coupe.
   2. Régler les paramètres du vibratome : épaisseur : 350 μm ; vitesse : 0,14-0,16 mm/s, amplitude : 1,0 mm et fréquence de vibration : 85 Hz.
   3. Récoltez 2 à 3 tranches appropriées par animal. Enregistrez 1 à 2 motoneurones FG+ sains par tranche, avec une plage de 5 à 6 cellules par animal.
8. Incubation
   1. Utilisez une pince à épiler à coulisse pour couper une tranche (Figure 1L) et placez-la dans la chambre d’incubation remplie d’ACSF oxygéné en continu. Placez la chambre d’incubation dans un bain-marie à 32 °C pendant 30 minutes, puis continuez à l’incuber à température ambiante (RT) pendant encore 30 minutes avant l’enregistrement.
      REMARQUE : Les procédures ci-dessus, de l’anesthésie à l’obtention de la première tranche, doivent être terminées dans les 20 à 30 minutes pour conserver autant que possible la viabilité des cellules. Les motoneurones de chaque tranche peuvent maintenir leur viabilité pendant environ 6 à 7 heures.

2. Enregistrement patch-clamp avec SCS (Figure 2)

1. Préparatifs
   1. Perfuser la chambre d’enregistrement avec de l’ACSF à bulles continues à un débit d’environ 1 à 2 mL/min. Réglez le débit individuellement via le panneau de commande de la pompe péristaltique.
   2. Placez une tranche dans la chambre d’enregistrement. Utilisez le fil de platine en forme de U avec des fils de nylon pour stabiliser fermement la tranche en place.
   3. Utilisez un microscope à contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) pour observer la tranche. Sous la lentille de l’objectif 4x, vérifiez que la longueur de la racine dorsale est d’environ 1 mm. Trouvez la zone où la racine dorsale pénètre dans le parenchyme, puis déplacez le champ de vision central vers cette zone.
   4. Connectez le générateur d’impulsions à des électrodes sur mesure (Figure 2A).
2. Configuration de SCS
   1. Placez l’anode de SCS près de la ligne médiane dorsale via le système de micromanipulation (Figure 2B).
   2. Placez la cathode de SCS près de la zone d’entrée de la racine dorsale (DREZ) via le système de micromanipulation (Figure 2B).
3. Ciblage et imagerie cellulaire
   1. Utilisez l’IR-DIC avec une lentille d’objectif 10x pour trouver grossièrement la région dorsolatérale de la colonne motrice, où se trouvent la plupart des motoneurones. Ensuite, déplacez le champ de vision central vers cette zone.
   2. Passez à une lentille d’objectif 60x pour trouver un neurone sain avec une surface lisse et brillante et des noyaux invisibles (Figure 2C,F).
   3. Diminuez légèrement l’intensité IR et allumez la source de lumière à fluorescence. Basculez le filtre de lumière sur le filtre d’excitation ultraviolette à large bande (Figure 2D,G), pour sélectionner un motoneurone FG-positif (FG+) approprié (Figure 2E,H).
   4. Utilisez des électrodes d’aspiration pour appliquer une stimulation du seuil moteur 1x à la racine dorsale. Si un potentiel d’action évoqué est détecté dans les motoneurones (Figure supplémentaire 3), cela confirme que l’activité de la racine dorsale est intacte. Si ce n’est pas le cas, cette tranche doit être jetée.
4. Enregistrement patch-clamp
   1. Remplissez la micropipette avec la solution intracellulaire et insérez-la dans le porte-électrode. Utilisez le système de micromanipulation pour abaisser la pipette dans le bain ACSF. La résistance de la pipette varie de 5 à 8 MΩ.
   2. Appliquez une petite quantité de pression positive sur la pipette pour souffler la poussière et les débris cellulaires.
      1. Abaissez l’électrode pour vous approcher de la cellule. Lorsque la pipette touche la surface du neurone FG+, une petite indentation de la membrane devient visible au niveau de la pointe. Relâchez la pression positive.
      2. Ensuite, appliquez une petite quantité de pression négative sur la pipette à l’aide d’une seringue. Cela crée une petite quantité d’aspiration qui met la membrane cellulaire en contact avec la pipette en verre. Faites toujours attention à la résistance totale sur l’interface logicielle jusqu’à ce que la valeur de résistance atteigne des gigaohms (>1 GΩ). Ensuite, le gigaseal est formé.
   3. Fixez le potentiel de membrane à -70 mV, puis appuyez sur le bouton de compensation rapide de la capacité sur l’interface logicielle de l’amplificateur. Appliquez doucement une pression négative transitoire pour rompre la membrane cellulaire, puis appuyez sur le bouton de compensation de capacité lente sur l’interface logicielle de l’amplificateur. À ce stade, une bonne configuration de cellules entières est obtenue.
   4. Passez en mode pince de courant en cliquant sur le bouton IC de l’interface logicielle et enregistrez le potentiel de membrane au repos (RMP).
   5. Appliquez le SCS pendant 1 à 2 s avec une amplitude de 1 à 10 mA, tandis que la largeur et la fréquence d’impulsion sont fixées à 210 μs et 40 Hz, respectivement. Déterminez le seuil moteur en augmentant lentement l’amplitude de stimulation jusqu’à ce que le premier PA soit observé.
   6. Distinguer les motoneurones à déclenchement retardé et immédiat à l’aide d’une injection de courant dépolarisant de 5 s autour de la rhéobase en mode pince de courant^10,11,12. Motoneurones à déclenchement immédiat : Une faible rhéobase peut induire un déclenchement immédiat et répétitif avec une fréquence de tir stable ; Motoneurones à décharge retardée : Une rhéobase élevée peut induire un début retardé de déclenchement répétitif avec une cadence de déclenchement accélérée (Figure 3).
   7. Lorsque SCS est désactivé, continuez à enregistrer le potentiel de membrane pour capturer le déclenchement spontané des points d’accès.
   8. Effectuez des enregistrements à pince de tension : des enregistrements à pince de tension pour le courant postsynaptique excitateur (EPSC) lorsque SCS est activé et désactivé. Le paramètre de stimulation est 1x seuil moteur, 210 μs, 2 Hz.

Résultats

Grâce à l’entretien rigoureux à basse température pendant l’opération fine (Figure supplémentaire 1, Figure supplémentaire 2 et Figure 1), la viabilité de la cellule était suffisamment bonne pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques ultérieurs. Pour simuler le scénario clinique autant que possible, nous avons utilisé la micromanipulation pour placer la cathode et l’anode SCS près de la ligne médiane dorsale et de la DREZ, respectivement (<...

Discussion

L’information de mouvement modulée par SCS est finalement convergée vers les motoneurones. Par conséquent, prendre les motoneurones comme cible de recherche peut simplifier la conception de l’étude et révéler plus directement le mécanisme de neuromodulation du SCS. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il y ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2